微生物的遗传变异与菌种选育

1、微生物的遗传变异与菌种选育,第一节 微生物遗传变异的物质基础 第二节 微生物的基因突变 第三节 微生物的基因重组 第四节 微生物的菌种选育 第五节 微生物的保藏与复壮,遗传(inheritance)和变异(variation)是生物体的最本质的属性之一,遗传与变异的概念,遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能.,变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变，在群体中以极低的几率（10-510-6）出现，性状变化幅度大；新性状稳定、可遗传。,遗传型（genotype）：一个生物体所含有的基因的总和。 表型（phenotype）：一个生物体所具有的一切外表特征和 内在特性的总和。,遗传型

2、+环境条件,代谢 发育,表型,变异的特点： 在群体中以极低的几率（一般为10-510-10）出现； 性状变化的幅度大； 变化后的新性状是稳定的、可遗传的；,指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,饰变,饰变的特点： 整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化； 性状变化的幅度小； 因遗传物质不变，故饰变是不遗传的；,由于微生物有一系列非常独特的生物学特性，因而在研究现代遗传学和其他许多重要的生物学基本理论问题中，微生物是最热衷的的研究对象。这些生物特性包括： 个体的体制极其简单； 营养体一般是单倍体； 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖； 繁殖速度快；,易于积累不同的

3、中间代谢物或终代谢物； 菌落形态特征的可见性与多样性； 环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性； 易于形成营养缺陷型； 各种微生物一般都有相应的病毒； 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等；,第一节 微生物遗传变异的物质基础,围绕遗传变异有无物质基础以及何种物质可承担遗传变异功能的问题，曾有过种种推测和争论。,18831889年间，Weissmann提出种质连续理论， 认为遗传 物质是一种具有特定分子结构的化合物。,本世纪初，发现了染色体并提出了基因学说，使遗传物质 基础的范围缩小到染色体上，并证明染色体是由核酸和蛋 白质组成的。,一、证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验：19

4、44年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验（肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验）,1944年后，连续利用微生物这一有利的实验对象进行了3个 著名的实验，并证实核酸尤其是DNA才是遗传变异的真正 物质基础。,（一）经典转化实验（transformation）：格里菲斯， 研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌） S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜 R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜,分别用降解DNA、RNA、蛋白质的酶作用于有毒的S型菌细胞抽提物,只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA是转化所必需的转化因子,Av

5、ery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。,（二）噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase， 1952年,首先，他们将E . coli培养在以放射性32PO43-或35SO42-作为磷源或硫源的组合培养基中。结果，可以获得含32P-DNA（噬菌体核心）的噬菌体或含35S-蛋白质（噬菌体外壳）的两种实验用噬菌体。,接着，他们作了以下两组实验：,（1）含32P-DNA的一组：放射性85%在沉淀中 （2）含35S-蛋白质的一组：

6、放射性75%在上清液中 所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。,实验有力证明，在其DNA中，含有包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（三）植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，H. Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的烟草花叶病毒（TMV）进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳（病毒1）和核酸（病毒2）,抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳

7、来自病毒1，而非病毒2,杂种病毒的后代蛋白质外壳表现为病毒2，而非病毒1,遗传物质是核酸（RNA）而非蛋白质,至此，一个共同的结论已确信无疑了：只有核酸才是负荷遗传信息的真正物质基础。,这里从三个不同角度来讨论遗传物质在细胞中存在形式。,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,（一）细胞水平 从细胞水平看，不论是真核微生物还是原核微生物，它们的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。,（二）细胞核水平 真核生物的细胞核有核膜包裹，形成有固定形态的真核，核内的DNA与组蛋白结合在一起，形成在光学显微镜下可见的染色体即基因组； 而原核生物的细胞核没有核膜包裹，呈松散无定形的核质体状态存在，这

8、种核基因的DNA不与任何蛋白质相结合。,现将微生物核外染色体的种类归纳如下：,遗传物质类型,核染色体（核基因组）,核外染色体（广义质粒）,原核生物的 真核生物的,真核生物的“质粒”,原核生物的质粒,细胞质基因（质体）,共生生物：卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒,线粒体叶绿体 中心体动体,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒,（三）分子水平,1、从核酸大分子水平来看，绝大多数生物的遗传物质是DNA，只有部分病毒的遗传物质才是RNA。 2、在生物体内，一切具有自主复制能力的遗传功能单位，都可称为基因。基因的物质基础是一个有特定核苷酸顺序的核酸片段。,启动基因 操纵子 操纵基因 基因

9、调控系统 结构基因 调节基因,3、遗传密码就是指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序； 每个密码子是由三个核苷酸顺序所决定的，它是负载遗传信息的基本单位。 把DNA上的遗传信息转移到mRNA分子上去，形成一条与DNA碱基顺序互补的mRNA ，这个过程叫做转录。,第二节 微生物的基因突变,基因突变（gene mutation）简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-810-9范围内。,（一）基因突变的类型,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型 抗性突变型 条件致死突变型,形态突变型 抗原突变型产量突变型,（1）形态突变型（

10、morphological mutant） 指由于突变而产生的个体或菌落形态所发生的非选择性变异。,特点：,非选择性突变 突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。,举例：,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,举例：,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。,形成芽孢缺陷菌株,细胞水平上的形态突变，突变株的检出更加困难。,（2）条件致死突变型（conditional lethal mutant）,某菌株或病毒经基因突变后，在某一条件下可正常地生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖的突变类型。,常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（

11、temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如25-30）下得到这种突变。,特点：,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,（3）营养缺陷突变型（auxotroph）,一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。,表型判断的标准,在基本培养基上能否生长,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段。,特点：,在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长。,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,影印平板

12、（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立。,（4）抗性突变型（resistant mutant） 由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性的变异类性。它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。抗性突变型普遍存在，例如对各种抗生素的抗药性菌株等。,（5）抗原突变型（antigenic mutant） 指由于基因突变而引起的抗原结构发生的变异类型。 具体类型很多，包括细胞壁缺陷变异、荚膜变异或鞭毛变异等。,（6）产量突变型 通过基因突变而获得的在有用代谢产物上高于原始菌株的突变株。 这类突变在生产实践上异常重要。,突变类型

13、 突变株的表型 成因 检出方法 营养缺陷型 因突变而丧失合成一 补充培养基 （auxotroph） 种或几种生长因子的 能力不能在基本培养 基上生长突变株 抗性突变型 因突变而产生了对某 药物培养基 （resistant mutant） 种化学药物或致死 物理因子的抗性 条件致死突变型 突变后在某种条件下 培养条件改变 （conditional 可正常生长、繁殖并 lethal mutant） 实现其表型，而在另 一条件下却无法生长 繁殖的突变型,突变株的表型 成因 检出方法 形态突变型 因突变而产生的个体 形态 Morphologycal 或菌落形态的非选择 （常用颜色变化） mutant

14、性变异 抗原突变型 因突变而引起的抗原 借助于抗原 antigenic 结构发生改变 抗体反应 mutant 产量突变型 因突变而获得的在有 测定产量或 high producing 用代谢物产量上高于 其它 mutant 原始菌株的突变株 其它突变型：毒力、糖发酵能力、代谢产物等,二、基因突变的特点 适用于整个生物界，以细菌的抗药性为例。 1.不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系。 （变量试验、涂布试验、平板影印培养试验） 2.自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生。 3.稀有性：突变率低且稳定。 4.独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。 5.可诱发性：诱变剂可

15、提高突变率。 6.稳定性：变异性状稳定可遗传。 7.可逆性：原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变（forward mutation），相反的过程则 称为回复突 变或回变（back mutation或 reverse mutation）。,三、基因突变的机制 基因突变的原因是多种多样的，它可以是自发的或诱发的，各种具体类型概括如下：,突变,碱基置换（转换、 颠换） 点突变 移码突变（缺失 、 添加） 诱变 畸变：缺失、添加、易位、倒位 自发突变,（一）、诱发突变机制,置换,转换：DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换。,颠换：一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌

16、呤所置换。,诱变剂：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。 1、碱基的置换 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。,对某一具体诱变剂来说，可同时引起转换与颠换，也可只具其中的一种功能。根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换，可把置换的机制分成以下两类来讨论。,（1）直接引起置换的诱变剂,一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基

17、配对的转换，并进一步使微生物发生变异。在这些诱变剂中，除羟胺只引起G：CA：T外，其余都是可使G：C A：T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。,（2）间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后而引起碱基置换，故是间接的。现以5-BU为例来加以说明。 5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5

18、-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的AT变至GC的转换。,2、移码突变,移码突变（frame-shift mutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。 由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frame shift mutant）。与染色体畸变相比，移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤。 丫啶类染料，如丫啶黄、

19、丫啶橙和-氨基丫啶等，都是移码突变的有效诱变剂。,丫啶类化合物的诱变机制,至今还不很清楚。有人认为，由于它们是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开（两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个丫啶分子时，就变成0.68nm），从而在DNA复制过程中，会使链上增添或缺失一个碱基，结果就引起了移码突变。,3、染色体畸变（chromosomal aberration）,某些理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起点突变外，还会引起DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变，包括以下两个方面： 染色体结构上的缺失

20、、重复、易位和倒位 染色体数目的变化。,染色体结构上的变化,染色体内畸变：只涉及一条染色体上的变化，如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因的减少或增加；又如发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180后，重新插入到原来染色体的位置上；易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上。 染色体间畸变：则指非同源染色体间的易位。,紫外线对DNA的损伤及其修复 1、光复活作用 把经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。 2、暗修复作用 也称切除修复作用，是活细胞内一种用于修复被紫

21、外线等诱变剂损伤后的DNA的机制。,（二）自发突变机制,自发突变是指在没有人工参与的情况下生物体自然发生的突变,几种自发突变的可能机制,背景辐射和环境因素的影响：由于一些原因不详的低剂量诱变因素的长期总和诱变效应。如各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质（在微环境中有时也可能是高浓度）的作用等。,微生物自身有害代谢产物的诱变效应：过氧化氢对Neurospora有诱变作用，在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。 氨基的互变异构效应：T和G会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现，而C和A则会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现。 环出效

22、应：在DNA的复制过程中，某一单链上偶然产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失。,几种自发突变的可能机制,第三节 微生物的基因重组,基因重组（gene recombination）：凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。 重组是分子水平上的一个概念，而一般所说的杂交（hybridization）则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一形式。真核微生物中的有性杂交、准性杂交等；原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞

23、水平上的反映。,基因重组的意义,基因重组是杂交育种的理论基础。 杂交育种的优点：由于杂交育种选用了已知性状的供体菌和受体菌作为亲本，故在方向性和自觉性方面，均比诱变育种前进了一大步。利用杂交育种可以消除某一菌株在经过长期诱变处理后所出现的产量上升缓慢的现象 杂交育种的缺点：杂交育种的方法较复杂，目前还没有得到普遍的推广和使用，尤其在原核生物的领域中，应用转化、转导或接合等重组技术来培育可应用于生产实践上的高产菌株的例子还不多见。到了70年代后期，由于原生质体融合技术获得巨大的成功后，才使重组育种技术获得了飞速的发展。,一、原核微生物的基因重组,转化 转导 接合 溶原性转变,基因重组的方式,（一

24、）转化（transformation）,转化或转化作用：受体菌（recipient或receptor）直接吸收了来自供体菌（donor）的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子（transformant）。 范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。 若干放线菌和蓝细菌及少数真核微生物也有转化报道。 转化发生的条件 两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。 进行转化的受体细胞必须处于感受态（competence），亦即受体细

25、胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态。,枯草芽孢杆菌的自然转化过程（革兰氏阳性菌的转化模型）,具体转化过程如下： 先从供体菌提取DNA片段，接着DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，在结合位点上，DNA片段中的一条单链逐步降解为核苷酸和无机磷酸而解体，另一条链进入受体细胞，这是一个消耗能量的过程；,进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区段配对，而受体菌染色体组的相应单链片段被切除，并被进入受体细胞的单链DNA所取代，随后修复合成，连接成部分杂合双链； 然后受体菌染色体进行复制，其中杂合区段被分离成2个，一个类似供体菌，另

26、一个类似受体菌； 当细胞分裂时，此染色体发生分离，形成一个转化子；,影响转化效率的因素： 受体细胞的感受态，它决定转化因子能否被吸收进入受体细胞； 受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解； 受体和供体染色体的同源性，它决定转化因子的整合；,（二）转导(transduction) 通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，就称转导子。,细菌转导的二种类型,普遍性转导,局限性转导,1、普遍性转导 通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误

27、包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。,普遍性转导的基本要求：,形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。,普遍性转导的三种后果：,特点：在选择培养基平板上形成微小菌落,转导DNA不能进行重组和复制，但其 携带的基因可经过转录而得到表达。,流产转导（abortive transduction）,进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。,外源DNA被降解，转导失败。,2、局限性转导（specialized transduction） 指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌

28、的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。 特点： 只能转导供体菌的个别特定基因； 该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带； 缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率“误切”，或由于双重溶原菌的裂解而形成，而后一情况下可以形成50%缺陷噬菌体；,温和噬菌体感染,整合到细菌染色体的特定位点上宿主细胞发生溶源化,溶源菌因诱导而发生裂解时， 在前噬菌体二侧的少数宿主 基因因偶尔发生的不正常切 割而连在噬菌体DNA上。,部分缺陷的温和噬菌体,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中,局限性转导与普遍性转导的主要区别：,a）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，

29、与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。,b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。,（三）接合(conjugation) 供体菌通过其性菌毛与受体菌相接触，前者传递不同长度的单链DNA给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞，就是接合子。 在细菌和放线菌中都存在着接合现象。,接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,F因子的分子量通常为5107，上面有编码细

30、菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,在细菌中，接合现象研究得最清楚的是大肠杆菌的接合,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+ 、 Hfr 、F ），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,根据细胞中是否存在F因子以及其存在方式的不同，可分为四种细胞形式：,（1） F+F-杂交,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞 的染色体DNA一般不被转移。,杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,（2）Hfr F-杂交,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此

31、只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会 就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F

32、因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。,（3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,细胞基因的这种转移过程又常称为性导、F因子转导，或F因子媒介的转导。,FF-与F+F-的不同：给体的部分 染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与染色体发生重组；,b）继续存在于F因子上， 形成一种部分二倍体；,（四）溶原性转变（lysogenic conversion）：,一个与转导相似又不同的现象,当温和噬菌体感染其宿主而使其发生溶原化时，因噬菌体的基因整合到宿主的核基因组上，而使后者

33、获得了除免疫性以外的新性状的现象。,溶源转变与转导的不同？,a）不携带任何供体菌的基因；,b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；,c）获得新性状的是溶原化的宿主细胞，而 不是转导子；,d）获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失；,二.真核微生物的基因重组,在真核微生物中，基因重组主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。 （一）有性杂交 有性杂交，一般指性细胞间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。 凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌，都能进行有性杂交。,生产实践上利用有性杂交培育优良品种的例子很多，例如，把用于酒精发酵的酵母和用于面包发酵的酵母两者杂交，就得到

34、了既能生产酒精，有对麦芽糖和葡萄糖有很强发酵能力的新菌株。,（一）有性杂交,（二）准性生殖 准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。 准性生殖常见于某些真菌，尤其是半知菌中。其主要过程为： （1）菌丝联结 （2）形成异核体 （3）核融合或核配 （4）体细胞交换和单倍体化,第四节 微生物的菌种选育,在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品及其代谢产物时，围绕菌种的工作，需解决四个方面的问题： 1。挑选符合生产要求的菌种选种； 2。改良已有菌种的生产性能育种； 3。避免菌种的死亡和

35、生产性能的下降菌种保藏； 4。菌种生产性能的恢复菌种复壮。,一.从自然界中分离筛选菌种的方法步骤,步骤主要有采样增殖培养纯种分离性能测定四步。,（一）采样 要根据选菌的目的、微生物的分布状况及菌种的特征与外界环境的关系来选择采样的地点。 采样方法：选好地点后用小铲子除去表层土取离地面5-15厘米的土壤几十克盛入预先消毒过的牛皮纸袋中，扎好记录采样的地点、时间及环境情况等。,（二）增殖培养,又叫富集培养法目的是增加所需的微生物数量。 方法：增加待分离微生物特定的养分和控制一定的培养条件使所需菌快速增长。（P149表6-2）,（三）纯种分离,稀释平皿分离法 常用的纯种分离法有 平皿划线分离法 组织

36、分离法,1。稀释分离法：将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布接种于培养基平板上，进行培养，长出独立的单个菌落，进行挑选分离。,（三）纯种分离,2。平板划线分离法： 1）涂菌：将接种环上的菌均匀的涂布在平板的边缘，使菌细胞个体彼此分开。 2）划线分离,分步划线法：适合于初级实验室工作人员,一次划线法：从涂菌部位起，一次性连续划蛇形线。线划得越密越好，但来回线不能重叠。,确保培养出单个菌落,3。组织分离法：主要是食用菌菌种的分离，以食用菌的子实体等作材料进行分离的方法。,（四）纯培养,是将分离到的目的菌种接种到试管斜面上，培养扩大的培养方法。（需先经形态鉴定）,（五）生产性能测定,分离到的菌种是否

37、具有生产上的使用价值，必须要进行发酵生产性能的测定，而后才能决定取舍。,一般均须经过多次重复筛选，并进行发酵条件的优化才能满足生产上的需要。,二、微生物的诱变育种,诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。 诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,（一）、诱变育种的一般步骤和方法,诱变,绝大多数 个体死亡 少数存活,多数未变 少数突变,多数负变 少数正变,多数幅

38、度小 少数幅度大,多数不宜投产 少数适宜投产,存活率 突变率 正变率 “高产率” “投产率”,出发菌株单细胞悬液,可计算：,诱变育种工作中应考虑的几个原则,1）挑选优良的出发菌株（original strain）,选用出发菌株的一般原则： 最好是经过生产中选育过的自发变异菌株； 采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株 选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株； 细菌中发现称为增变菌株的变异菌株，更适宜作出发菌株； 在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，最好考虑至少能累积少量所需产物或其前体的菌株，而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有

39、一定程度提高的菌株作为出发菌株。,2）处理单孢子（或单细胞）悬液,对单细胞微生物必须处理单细胞、均匀悬液的原因 分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂，避免长出不纯菌落。 处理霉菌或放线菌孢子的原因： 丝状微生物的细胞内同时含有几个核，故某一突变无法反映在当代的表型上。只有当经过DNA的复制发生细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫表型延迟（phenotypic lag） （或由于诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，也会出现表型延迟）。这也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。 细胞的生理状态对诱变的效果会发生很大的影响。 获得

40、均匀分散的细胞悬液的方法：用无菌的玻璃珠打碎成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤。诱变后出现的不纯菌落，则可用适当的分离纯化方法加以纯化。,诱变育种工作中应考虑的几个原则,诱变育种工作中应考虑的几个原则,3）选择简便有效的诱变剂：,物理诱变剂：紫外线、激光；X射线、射线和快中子等。 化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。 拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱发一般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。 由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。同样，凡能引起核酸

41、的其他功能改变的因素，一般也能引起突变。,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果 最为显著的“超诱变剂”，如NTG(N-甲基-N-硝基- N-亚硝基胍)。 采用简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，

42、在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。,4）充分利用复合处理的协同效应（synergism）,诱变育种工作中应考虑的几个原则,诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应，这对育种工作是很有参考价值的。复合处理有几类： 两种或多种诱变剂的先后使用； 同一种诱变剂的重复使用； 两种或多种诱变剂的同时使用。,诱变育种工作中应考虑的几个原则,5）选用最适剂量,诱变剂剂量一般指强度与作用时间的乘积。各种诱变剂有不同的剂量表示方式，如化学诱变剂以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。在育种实践中，常以杀菌率来作诱变

43、剂的相对剂量。 诱变剂的合适剂量：凡在提高诱变率的基础上，能扩大变异幅度，促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。 要确定一个合适的剂量，常常要经过多次试验。就一般微生物而言，在一定的剂量范围内，突变率往往随剂量的增高而提高，但正变较多出现在偏低的剂量中，而负变则较多出现在偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前大家比较倾向于采用较低的剂量。,6）筛选方法,诱变育种工作中应考虑的几个原则,一般通过初筛与复筛对突变株进行生产性能的测定。 初筛既可在培养皿平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊。 复筛是对突变株的生产性能作比较精确的定量

44、测定。一般是将微生物摇瓶培养，然后再对培养液进行分析测定。 不仅需要设计效率更高的筛选方法，还应努力推广筛选操作的自动化。,（二）营养缺陷型突变株的筛选及其应用,1、与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,基本培养基（MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基，称基本培养基。可用符号“”来表示。 完全培养基（CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的组合培养基，可称为完全培养基。可用符号“”。 补充培养基（SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基，称为补充培养基。补充培养基的符号可根据加入的是A或B等代谢物而分别用A或B等来表示。,2、营养缺陷型的筛选方法

45、,（二）营养缺陷型突变株的筛选及其应用,诱变剂处理 淘汰野生型： a.抗生素法 青霉素主要适用于细菌。其原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，因而能杀死生长繁殖着的细菌。 制霉菌素法则适用于真菌。制霉菌素属于大环内酯类抗生素，可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起细胞膜的损伤。,b.菌丝过滤法：适用于丝状生长的真菌或放线菌。其原理是，在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。,检出缺陷型（夹层培养法、限量补充培养法、逐个检出法、影印接种法） 鉴定缺陷型（生长谱法）步骤如下：1、含营养缺陷型菌株的基本培养基平板的制备。2、营养缺陷型营养类别的鉴定。3、缺陷型菌株单一营养因素的鉴定。,（二）营养缺陷型突变株的筛选及其应用,2、营养缺陷型的筛选方法,（二）营养缺陷型突变株的筛选及其应用,3、营养缺陷型菌株的应用,1）利用营养缺陷型菌株定量分析各种生