生物样品超薄切片技术

1、生物样品，通常的样品调制技术，特殊样品调制技术，第四章透射电子显微镜生物样品的制造技术，第一节载体网和支撑膜第二节极薄切片的制作第三节负染色技术，第一节载体网和支撑膜，第一，载体网：用于承载样品的(直径3mm )网状材料。 1 .载体网的类型和选择：70%的透过率，2 .载体网的清洗：酸碱法和有机溶剂、蒸馏水等清洗干燥。x射线元素分析、常规极薄切片(200目以上)、细胞化学、二、样品支撑膜、为增强样品强度，在载流子网表面铺上薄膜。 1 .对膜的要求：其本身没有结构，薄透明，有充分的机械强度，电子束容易通过，与能承受电子束撞击的样品不发生化学反应。 厚度1015nm，2 .常用支撑膜及其制造，福

2、莫瓦膜(Formvar):化学名称：聚乙烯缩甲醛.特征：机械强度高，制作简单.制作： 0.20.5%的氯仿溶液，玻璃片开封，水面剥离法。 操作方法，1 .福尔摩巴支撑薄膜的制作方法，2 .火棉凝胶膜用平盘水面展开法：在平盘中加入蒸馏水，滴下13%的火棉凝胶膜液，等待溶剂挥发后，在薄膜上放置干净的铜网，捞滤纸。 3 .碳膜的制作：通过真空喷涂法的膜。 第二节极薄切片的制作、极薄切片：厚度小于100 (5070 )纳米的切片。 要求：厚度均匀，厚度符合标准的无皱纹刃痕、颤抖、无沉淀细胞结构保存良好，具有良好的电子对比度，具有一定的机械强度。 制作流程：六大股，四十多次操作，采访固定脱水包埋切片染色

3、，镜检，极薄切片制作流程图，一、采访，包括从动植物机体和细胞和微生物培养物获得必要的研究材料的操作流程。 1 .采访原则要求：准、速、小、冷、轻的原则。 正确：根据研究目的确定采访部位，取得典型部位。 迅速：材料分离后，请在1分钟内投入固定液。 体积小：固定液的渗透力受到限制，样品体积为1mm或13mm长。 低温：固定液和器材需要预冷(04 )，降低自溶解酶的活性。 防止损伤：器械锐利，切断轻，防止压迫，牵引损伤组织细胞的内部结构。采访固定脱水包埋切片染色镜检，2 .采访方法：动物材料的获得：急性死刑或麻醉后，用12分钟解剖所需材料，切成标准块立即投入固定液，在低温(04)下保存的特殊难取的材

4、料在insitu固定或灌流固定后，再采访固定液投入植物材料的取得：叶切13长度的根，茎切标准块，表面有毛刺的材料经酶处理软化，表面有蜡的叶去蜡，用蒸馏水清洗后采访固定。 悬浮样品的取得：加入适量的固定液悬浮固定后，用低速离心收集团块进行固定。 保持低温，野外采访：拿着冰壶保存固定液和材料，确保动物材料现场固定植物材料可以保湿带回实验室后进行采访固定。采访固定脱水包埋切片染色镜检，二、用固定、化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程，1 .固定的目的：在分子水平上忠实地保存组织细胞的生活状态的细节，尽量减少细胞死后的变化。 2 .固定类型：3 .固定液的作用：快速均匀地渗透到细胞内部，使各种细胞成分稳

5、定，破坏细胞的酶系，阻止细胞自溶解，通过化学作用建立分子交联，提供形成细胞骨架的一定电子对比度。极低温急速冷冻固定法，使用化学试剂快速杀死细胞，取材固定脱水切片染色镜检查，12.0%，4 .常用固定剂及其特征，甲醛类：甲醛，戊二醛，聚甲醛和丙烯醛，甲醛：渗透力无法保存核酸、核蛋白，保存在微管、内质网等细胞膜系统中较好的脂质，无电子染色作用。 调制方法：在2.05.0%中配合常用0.1M的磷酸缓冲液(pH6.87.2 )。 选择：单细胞微生物动物组织植物组织厚壁组织，5.0%，锇酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染色作用。 不能固定脂蛋白和核蛋白，不能保存核酸和糖类。 采访固定脱水

6、包埋切片染色镜检查，5 .固定方法：(1)单固定法：用于容易渗透的材料和酶的细胞化学，(2)双固定法：用于戊二醛锇酸双重固定，(3)原位固定法：用于解剖困难、对缺氧敏感的组织器官(4)灌流固定：通过血液循环的途径，将固定液注入相应的部位，等组织适度硬化后再进行解剖采访，通常进行固定。戊二醛、采访固定脱水包埋切片染色镜检查，直接影响被固定细胞本来的特定形态，6 .影响固定效果的因素，(1)固定液的碱度：固定液的碱度必须与固定材料的碱度大致一致。 例如，大多数动物的pH值平均为7.4，所以常用PH7.27.4的植物的pH值为6.87.1，因此常用PH7.07.2的原生动物和胚胎的pH值为8.08.

7、5、胃粘膜pH值为8.5的效果最高，(2)固定液的渗透压：固定液和固定电解质：钾碱石灰玻璃(0.5% CaCl )是模仿防膨胀的非电解质：蔗糖、葡萄糖膜系稳定剂、采访固定脱水包埋切片染色镜检查，(3)缓冲液类型、磷酸缓冲液：细胞外液成分调制而成，无毒富含生理功能。 适合配合各种固定液和材料的冲洗液。 二钾肾酸盐缓冲液，有毒、稳定性好。 适合细胞化学和保存脂肪的样品处理、钙离子定位研究，不可长期保存，取材固定脱水包埋切片染色镜检查： (4)根据固定时间、温度和样品块的大小、时间：材料，单细胞和动物材料短，植物材料和厚壁组织长。 一到十二个小时。 温度：低温下抑制酶活性，通常在04的条件下固定。

8、样品块大小：受固定液渗透能力的影响，小块材料容易被良好地固定。采访固定脱水包埋切片染色镜检，7 .注意事项，(1)控制固定温度04抑制酶的活性，减少细胞自溶。 (2)把握固定时间：根据材料的种类和特征，后固定时间不要太长。 不那样的话容易变成碎片。 (3)充分漂洗：去除残留固定液。 (4)特殊材料的特殊处理：植物和较松的材料：吸入后沉入固定液的厚壁组织：采用低压容器或振动方式促进渗透的表面有蜡质材料：要脱蜡后再固定。 采访固定脱水包埋切片染色镜检查，三、脱水、脱水是指代替组织细胞中的游离水而使用适当的有机溶剂。 1 .必要性：水分的存在影响非水溶性包埋剂的渗透，进而影响切片的完整性，2 .常用

9、脱水剂：醇类(乙醇)和丙酮，3 .脱水方法：梯度系列脱水法。 30%50% 70% 80% 90 %95% 100%2次，4 .注意事项：脱水中断只有70%，高浓度脱水剂容易使组织变脆，成分提取； 最终脱水剂为了保证脱水完全，首先必须用吸水剂处理的高浓度脱水操作，必须尽快防止样品内进入空气或吸水。、采访固定脱水包埋切片染色镜检，四、渗透和包埋：用包埋剂逐渐置换样品中的脱水剂，用包埋剂填充细胞内外的所有空隙，聚合后，形成适合机械切断的固体包埋块。 1、包埋剂：理想包埋剂的特点：粘稠度低，易渗透的聚合均匀，抗体积收缩的电子束冲击，高温不变形，不升华本身没有结构，具有良好的切割性能，切片容易染色。

10、常用的包埋剂：非水溶性(Epon812 )和水溶性包埋剂。包埋剂Epon812或618硬化剂DDSA (十二烷基琥珀酸酐) MNA (六甲酸酐)增塑剂DBP (邻苯二甲酸二丁酯)催化剂DMP-30用于618，一边脱水一边包埋，采访固定脱水包埋切片镜检，2 .渗透，4 .渗透和包埋剂：转移剂的比例根据1 :31 :13:1纯包埋剂、渗透时间：材料而不同，3 .包埋、通常包埋：用牙签将材料选择为模具，注入包埋剂，做标记，定向包埋：样品进入浅槽中，定向性、注射剂、标签4 .聚合，37 (12h)45(12h)60(24h )，采访固定脱水包埋染色镜检查，5，极薄切片，制刀修块切片展片捞片，1 .切片

11、刃：金刚石刃，制作玻璃刃：2 .修块：样品要点：上下必须平行，形状：前端面为梯形锥体(金字塔形)，取材固定脱水包埋切片染色镜检查，3 .切片，安装刀，水：特别注意刃的高度和倾斜角，液面的高度，切片，捞片：切片带用睫毛笔收集切片厚度的判断：根据切片表面的反射光和切片下面的反射光的干涉色，厚度不同的切片呈现不同的颜色。 取材固定脱水包埋切片染色镜检，六、染色，1 .染色原理：结合或吸附重金属盐类和样品中的某些成分，达到增加电子散射量提高对比度的目的. 电子染色，2 .电子染色剂：特异性，常用染色剂可以提高铀和铅盐、乙酸铀：核酸、蛋白质和结缔组织的对比度，膜系染色不良。 调制：13%的50%或70%

12、的乙醇溶液，遮光保存。 铅盐：对膜系、糖元、核蛋白、脂质有很好的染色作用。 常用硝酸铅和柠檬酸钠水溶液配合柠檬酸铅。 容易产生沉淀污染样品。 调制：硝酸铅1.33g柠檬酸钠1.76g双蒸馏水30ml，pH 1112，ph 4.2，30 min，用力摇动乳状悬浊液，加入8ml 1N的NaOH，溶液变透明后向50ml中加入水，采访固定脱水包埋切片染色镜检1航空航空航空航空653，(2)双重染色：铀-铅染色法，(3)块染色：铅-铀-铅染色能提高对比度，铀染色2030分钟，铅染色1530分钟，水洗303次，材料固定后，脱水前，整体50%航空、采访固定脱水包埋切片染色镜检查，4 .示踪染色，免疫电子显微

13、镜技术和(酶)细胞化学技术，采访固定脱水切片染色镜检查，(1)概念：以各种大小的离子、分子等粒子为示踪剂显示细胞间的连接部位和方式，研究细胞的透过屏障(2)常用示踪：硝酸镧(2nm )、辽红(0.76nm )、无机胶体金、草酸钙及酶类、铁蛋白等。 (3)染色方法：通常在所有处理液中加入示踪剂。、硝酸镧标记的葱根尖细胞镧粒子沉积在细胞间隙，利用电子显微镜的高分辨率和扩增能力，在超微结构和分子水平上研究细胞的形态和功能，利用免疫抗体反应的特异性和组织化学形态的可见性。 可以进行细胞内抗体抗原的定性、定位研究。 例如，免疫铁蛋白、酶(辛辣过氧化酶)、胶体金对铁蛋白抗体、酶标记抗体、胶体金标记抗体的定

14、位、电镜细胞化学技术：在尽可能保存细胞超微结构的同时，在insitu用电子显微镜显示生化反应，结合结构和功能的研究。 如酶在细胞内的定位核酸(DNA，RNA )脂肪、碳水化合物的定位各种无机离子(钙离子)定位等胶体金标记的叶片、极薄切片制作总结，一、制作过程应掌握“六要一防”，采访要正确固定。 适时漂洗要充分脱水必须完全染色切片防止污染，二、不同材料制作特征：动物组织：取材迅速、固定及时的植物材料：调节处理时间、完全确保渗透的游离细胞：注意收集样品不丢失花粉、花粉、藻类：事前包埋收集、 三.处理时间，正确的防止损伤，24h，3次/15min，12h，8次/15min，34h，2次/15min，

15、3次/48h，铀染： 1530min，500700，微黄色、黑色或1 .负染色：即利用阴性染色电子密度高、电子显微镜下不显示结构的重金属盐类在样品周围的沉积，增强样品周围的电子密度，突出样品的形态和大小。 2 .原理：电子束通过高原子序数的物质时，其电子和原子核碰撞的概率很高，会产生散射，容易形成负对比度。 任何物体都被密度为其自身2倍以上的物质包围，或者被浸渍的情况下，用电子显微镜增强对比度，形成负对比度。 二.负染色样品的制备，具有一定浓度和纯度的悬浊液，(一)直接取样法：用于杂质少、具有一定浓度的样品，一.生长在固体培养基上的微生物：用接种环将二蒸馏水悬浊液刮掉，就可以滴下或附着样品。

16、2 .放线菌孢子：二蒸馏水从菌体洗去悬浊液就能滴下来。 3、皮肤疱疹(水痘等)用毛细管穿刺取样，直接滴下膜。 4 .植物染病体：切断后，蒸馏水漂浮一段时间就会附上样品。 必须保持生物植物，冲破表皮滴下蒸馏水，病毒游离的话就会附着样品。 负染色样品制备，(二)样品精制法：用于杂质大的材料，1 .离心精制法：用于血清、粪便、尿样、痰液、生组织、植物研磨粉碎悬浊液，低速离心： 25003000rpm，10min，丢弃沉淀物(细胞碎片)高速离心： 15000 2 .透析精制法：除去盐类杂质，浮游于水面的膜静置透析甲醛蒸气固定1520分钟，静置透析324小时，3 .琼脂过滤精制法：琼脂过滤20分钟，蒸馏水浮游剥离网染色，(3)病毒样品浓缩法，1 .红细胞吸附法：多个粘液病毒和亚粘液病毒将病毒悬浊液和等