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文档简介

1、一、 免疫共沉淀 COIP1. 免疫沉淀 IP:概念:利用抗原与抗体特异性结合的特征,将抗原(靶蛋白)从混合体系中沉淀下来,初步分离靶蛋白的方法2. 免疫共沉淀 COIP:概念:一种在体外检测蛋白和蛋白之间是否存在特异性相互作用的方法。如果两个蛋白在体外能发生特异性作用,那么当一种蛋白的抗体进行沉淀时,另一个蛋白也被同时沉淀下来3. 应用:纯化蛋白、浓缩蛋白、蛋白质相互作用验证4. 原理:. 靶蛋白A与蛋白B结合,但无法检测. 加入靶蛋白A的特异性抗体,此时抗体Fab段与靶蛋白A结合,但仍无法检测. 加入protein A/G+bead,proteinA/G可特异性结合抗体Fc段,bead是琼

2、脂糖珠. 复合物结合ProteinA/G+bead后,则可通过离心沉淀下来复合物. 加热变性后,复合物分离,则可通过western blot观察是否有靶蛋白和蛋白B条带即可说明两者有特异性结合。5. 局限性:倘若蛋白B与靶蛋白的结合是瞬间性即解离的,或两种蛋白中间有第三者起作用,则无法检测出来。细胞实验:1. 工作台准备:UV30min,开灯、通风2. 提示系统安全后开始工作3. 用酒精擦拭工作台桌面4. 物品准备:移液枪、枪头、吸管、垃圾桶(固液分开)、培养基、血清(放架子上)5. 水浴恒温箱打开 376. 注意事项:盖子朝下、及时关盖、枪头不要碰触瓶壁、看细胞先用75%酒精擦拭显微镜台面,

3、看完后关灯二、 细胞传代技术1. 吸光培养瓶中的培养液,PBS洗涤6ml2. 加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液,覆盖整个瓶底,静置2-10分钟3. 吸去胰蛋白酶液,加入含FBS的DMEM4. 用吸管吸取瓶内培养液,反复吹打瓶壁细胞,形成细胞悬液5. 吸取1/10-1/40细胞悬液,接种于新的培养瓶,并加适量DMEM+FBS于新培养瓶6. 放入培养箱培养三、 细胞冻存技术1. 冻存液内含10甘油或二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO),它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶

4、,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。2. 冻存液配置:70%DMEM+20%FBS+10%DMSO,冻存前需换液一次3. 待存培养皿吸光培养液,加入1-2ml 0.25%胰蛋白酶,静置2-10分钟4. 吸去胰蛋白酶,加入培养基,离心(2000、3min),去上清,加冻存液,吹打5. 标记后4放30分钟,再移入-80保存。四、细胞换液技术:1. 观察培养基颜色是否浑浊等,并观察细胞生长状况2. 取下盖子,倒掉培养基3. 拿出PBS瓶子,吸取3mlPBS,打入培养皿,晃动后倒掉,重复一次4. 打入培养基10ml,盖上盖子,显微镜下观察,标记日期名称五、细胞增殖试验 MTT1.原理:细胞内线粒

5、体脱氢酶可以还原MTT,MTT还原产物和细胞色素C反应生成结晶,结晶数量与细胞数成正比,且溶于二甲基亚砜DMSO. 2.将细胞消化吹散,96孔板每孔接种3000个细胞3.细胞贴壁24h后加入MTT 20ul/孔,继续培养4h4.吸尽液体,加入DMSO150ul/孔,摇床放置10min5.酶标仪测定OD490nm读值,连续监测5天并绘制生长曲线六、细胞质粒转染1.将3.5105细胞接种于六孔板,以无抗生素的培养基培养,待细胞融合度至90%进行转染2.将1-2ug的质粒加入250ul的Opti-MEM,再取5ul Lipofectamine 2000加入250ul的Opti-MEM混匀,分别静置5

6、min。3.将上述两者混匀,室温放置20min4.将500ul混合液加入细胞,4-6h更换培养基,继续培养48h后处理细胞七、miRNA/siRNA转染1.将2105细胞接种于六孔板,以无抗生素的培养基培养,待细胞融合度到50%进行转染2.将5ul20uM的miR或siRNA加入250ul Opti-MEM轻柔混匀,吸取5ul RNAi MAX加入250ul Opti-MEM轻柔混匀,分别静置5min3.将上述两者混匀,室温静置20min4.上述500ul混合液加入细胞,轻轻摇晃六孔板,培养24-48h后处理细胞八、TransWell迁移和侵袭试验1.细胞消化后用无FBS培养基洗涤3次并重悬吹

7、散,配成2.5105个/ml细胞悬液2.细胞迁移:200ul细胞悬液加载TransWell小室中3.细胞侵袭:50ul Matrigel铺平在TransWell小室中,培养箱中风干4-6h,再把200ul细胞悬液加载TransWell小室中4.20%FBS培养基加至下室,继续培养24-48h5.小室在甲醇中固定15min,以0.1%结晶紫染色20min,PBS反复洗涤并擦拭掉上室的细胞6.随机挑5-8个高倍镜视野拍照,细胞计数九、细胞计数1.弃培养基 PBS冲洗2.胰酶消化3.加6mlDMEM重悬4.取20ul于1.5mlEP管仲,加入20ul台盼蓝,混匀5.取计数板,盖玻片10ul混匀液加入

8、,静置2min待细胞固定后计数6.读取十字架四周四个视野细胞数(记上不记下,记左不计右),即细胞个数/ml=(四个象限)*0.5*104个/ml十、western blot1.步骤:细胞培养/蛋白制备SDS-PAGE电泳转膜封闭加抗体免疫反应洗膜曝光2.原理:SDS将蛋白质结构从四级展开成一级,并包绕蛋白带上负电荷由于此时所有蛋白都有相同负电荷和结构,则电泳距离只与分子量大小有关电场作用下,待SDS负电荷蛋白向正极运动,受PAGE网状结构阻碍,分子量小移动快封闭:转膜后,膜上没有结合蛋白质的空白位置要用封闭液(脱脂奶粉)填满,否则背景信噪增高3.试剂:TBST缓冲液:含Tris-Hcl,Nac

9、l,Tween20TBS:不含Tween的TBSTPBST磷酸盐Tween缓冲液:含磷酸盐缓冲液+Tween20Tween20:非离子型表面活性剂,具有乳化增容稳定作用BSA:牛血清蛋白Acrylamide/bias solution:聚丙烯酰胺,Tween催化APS(过硫酸铵)产生自由基,自由基引发丙烯酰胺聚合。Tris-Hcl:缓冲液,广泛用于做蛋白质与核酸的溶剂,稳定电泳过程中PH值封闭液:脱脂奶粉5%+TBST压胶:注入分离胶后需要加异丙醇压胶,因为空气中O2氧化APS减弱活性,且压胶使层面平整。Loading buffer作用:指示剂,观察电泳进度,密度大,携带样本沉降到底部,含SD

10、S,使蛋白变成一级结果并带负电荷3.配胶:准备好玻璃板,用擦镜纸擦干净,底部放灰棉条夹好先加resolving胶,至距离绿线0.6cm(因成胶会缩小),加异丙醇压胶30min看到一清楚分界线或剩余胶已凝,倒去水,滤纸吸干加入Stack胶 30minstacking get:浓缩胶,孔径大,使所有蛋白进入分离胶处同一水平线resorting get:分离胶,孔径小,小的蛋白移动快胶配好村冰箱1周都可以用。将整块玻璃板用保鲜膜包好,密封袋装好4.电泳:配电泳液,泡尽量少放入电板中,红正黑负,电泳液过胶面,卡紧拿下梳子,上样,marker 4ul,蛋白样品30ug/孔,上样插深一点,打慢一点跑电泳,

11、调电压,看时间选择恒压,跑浓缩胶 60-100V 45min,跑分离胶120-200V 90min,电压高,跑得快,但是条形容易变形5. 转膜: 找一块黑板、透亮孔板,2张滤纸,2个海绵 PVDF膜用甲醇泡2分钟,带正电,亲水性 配好转膜液,新的转膜液倒入电泳槽,回收可用于倒入水槽,做夹心三明治 夹心制作:泡在转膜液中,透明板上方,黑板下方 加一块海绵,滤纸、胶(Marker在右边,大分子在上边),PVDF膜、滤纸、海绵夹好,排干净气泡 黑板对黑色负极,透明板对红色正极 恒压100v,1h,20-80kd用,或400mA恒流 注:PVDF膜,0.28um用于10-20kd蛋白,0.45um用于

12、20-80kd 取膜夹取Marker那边,不要碰到蛋白样品 取出膜,泡洗TBST,剪膜,放在滤纸上剪,用剪角做标记6. 封闭: 5%脱脂奶用TBST配,2.5g奶粉:50mlTBST 室温摇床1h 也可4过夜摇 孵育:配一抗二抗,配成1:500/1000/2000具体按经验 一抗4过夜,去冷房 二抗室温1h 一抗而抗后用TBST洗10min3次7.曝光:装备(暗盒、A液B液,1ml枪,枪头,胶片,计时器),带到9楼暗室 A/B液1:1,各1ml 第一张片子30s,放入机器中,大约45s出片,如果条带不深可以延长时间 如果发现抗体有问题,用TBST洗掉AB液,重新孵育1抗2抗 过胶片的机子:先经

13、过第一缸洗去未结合的染料,再经过第二缸强化已结合的染料,最后水洗?十一、qPCR1. 备冰盒,配10ul体系2. 10ul体系包括SYBR (+ROX)5ul,H2O 3.2ul,F引物/R引物 0.4ul*2,cDNA 1ul3. 先配好要做的加样试剂,设有两组,每组10个样本要加样,则如下图所示:组A:跑18s内参样品孔*10组A:跑18s内参样品孔副孔*10组A:跑目的基因样品孔*10组A:跑目的基因样品孔副孔*10组B:跑18s内参样品孔*10组B:跑18s内参样品孔副孔*10组B:跑目的基因样品孔*10组B:跑目的基因样品孔副孔*104. 即若有X组,每组Y个,则需要4XY个9ul体

14、系(无cDNA),这总体系又分成两种,一种是检测18s内参的,一种是检测目的基因的。即每次跑PCR的时候,需要18xy ul的18s体系和18xy ul的目的基因体系5. 18xy ul的体系中需要:10XY ul的SYBR6.4XY ul的H2O0.8XY ul的F引物(18s/目的基因)0.8XY ul的R引物(18s/目的基因)6. 两组18xy ul的体系,每孔加9ul,加上原本cDNA 1ul,共10ul体系,cDNA先离心甩下7. 配好后予贴膜封装后去719整板甩甩8. 去PCR仪旁放进样本,设定参数,开始跑PCR十一、测核酸浓度1. 准备好纸巾、标本、2ul枪头/枪、DD水,去8

15、楼符立梧实验室2. 登记,打开NANO软件,选择测核酸3. 用纸巾擦干仪器监测点4. 用DD水2ul沾监测点,选择blank5. 当blank恢复可按模式后,代表DD水位OD值0设置完毕6. 纸巾擦干监测点,吹匀标本,抽取2ul粘监测点7. 选择measure,得出浓度与OD280/260,记录十二、提取RNA1. Trizol处理15分钟(-80可保存1年)2. 加入1/5体积氯仿(如1ml trizol+200ul氯仿),震荡静置10分钟,每5min震荡一次3. 4,12000rpm,15min则上层水+RNA,中层蛋白,下层氯仿4. 取400ul上层水相至另一离心管,余下放4(剩余部分上层水相做留底)5. 取出来的上层水相加等体积异丙醇(400ul)6. 上下颠倒10min7. 4 12000rpm 15femin,弃上清,留RNA8. 加75%乙醇(DEPC水配),静置10min9. 4,12000rpm,10min,弃上清10. 4,12000rpm,10min,吸尽上清11. 通风橱15min ,成透明胶装12. 加DEPC水50ul13. 测RNA浓度十三、RNA逆转

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