实验一蛋白质含量测定

1、实验1蛋白质含量的测定名称：芒果一、实验原理在生化实验中，经常需要测定蛋白质含量。常用的测定蛋白质含量的方法有紫外吸收法、福林酚试剂法和一些改进的劳里法。紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是酪氨酸中的苯环和蛋白质中的色氨酸含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的特性，吸收峰在280纳米，蛋白质溶液的光密度与其含量成正比。该方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，但容易受到核酸分子中嘌呤和嘧啶的干扰，准确度差。根据蛋白质和核酸吸收峰的不同，核酸的干扰可以通过计算得到适当的校正。劳里法的原理是，在碱性条件下，蛋白质和铜离子形成铜-蛋白质络合物，该络合物可以还原磷钼酸-磷钨酸(福林试剂)，产生钼蓝和钨蓝的深蓝

2、色混合物。这种方法很敏感，但很耗时。为了测量膜蛋白或非常稀(例如1ug/ml)的蛋白溶液的含量并减少洗涤剂、脂类和碳水化合物的干扰，可以使用一些改进的Lowry方法，例如蛋白-染料结合法。原理是当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，在一定的蛋白质浓度下，吸收值呈线性相关。因此，可以通过使用蛋白质OD595的标准浓度作为标准曲线来获得待测样品的蛋白质浓度。该方法简单、经济、快速、灵敏。应该注意的是，染料和蛋白质的结合可以在3分钟内完成。由于染料试剂含有酒精且易挥发，结合形成的络合物可在1小时内稳定存在于溶液中，标准曲线的背面会发生弯曲。二。实验过程(劳里

3、法)1.溶液制备液体a: 2%Na2CO3，用0.1摩尔/毫欧制备。(氢氧化钠和碳酸钠干粉不能混合，因为会释放二氧化碳，所以不准确)溶液：0.5%硫酸铜，用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。溶液c:使用前按50:1将溶液a和溶液b混合，当天使用。溶液D:福林试剂标准蛋白质溶液：200微克/毫升牛血清白蛋白溶液2.标准曲线的测定根据下表，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，并记录A500。取两组的测量平均值，以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。3.将样品稀释至标准曲线浓度范围，按照上述方法测量A500，并按照标准曲线读出蛋白质浓度。管号0112233445566标准蛋白质00

4、.050.050.10.10.20.20.30.30.40.40.50.5水0.50.450.450.40.40.30.30.20.20.10.100试剂c2.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.5在20-25下放置10分钟试剂d0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25立即摇匀，在20-25水浴30分钟A50000.0110.010.0280.0270.0590.060.0870.0880.1140.1150.140.141平均值00.01050.02750.05950.08750.11450.

5、1405未知蛋白溶液的A500为0.076。0.070，平均值为0.073。三。数据处理实验中的蛋白质浓度及其相应的吸光度值如下表所示：蛋白质浓度/微克/毫升0204080120160200A50000.01050.02750.05950.08750.11450.1405根据上表，绘制如下标准曲线软件拟合的线性方程为Y=7.17278E-4*X-6.73208E-4，R2=0.99803，表明拟合效果较好。未知蛋白质溶液的A500平均值为Y=0.073，未知蛋白质溶液的浓度计算为102.7微克/毫升。四.注意事项及分析1.由于福林试剂只在酸性条件下稳定，而在实验中还原反应只在酸碱度=10时发生，当福林试剂加入碱性铜-蛋白质溶液中时，必须立即混合，这样还原反应才能在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前发生。2.添加蛋白质溶液和