黄曲霉毒素残留检测

1、黄曲霉毒素残留检测,管大平 2012年7月13日,主要内容,一、黄曲霉毒素介绍 二、黄曲霉毒素检测方法 三、黄曲霉毒素检测过程质量控制 四、黄曲霉毒素检测安全防护,黄曲霉毒素,黄曲霉毒素危害事件： 1960年，在英国东南部一些农场中，有大约10万只火鸡不明原由地突然死亡，一时间在人群中造成了极大的恐慌和不安，当时命名为“火鸡事件”。1961年发现饲料中混有的花生粕能够使大鼠诱发肝癌，1962年鉴定了这种致癌物质，并命名为黄曲霉毒素。从此，世界各国科学界开始对真菌毒素的研究引起了广泛的重视。,黄曲霉毒素的产生 由曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和伪溜曲霉4种产生。 五种黄曲霉毒素： B1、B2

2、、G1、G2、M1。 黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。,黄曲霉毒素的致癌性 国际肿瘤研究机构 IARC分类定为1级致癌物 致癌力是奶油黄的900倍，苯并芘的4000倍。 黄曲霉毒素 B1同肝细胞DNA的鸟嘌呤碱基结合，使得控制细胞生长的基因代码发生错误，从而使细胞生长失控，成为癌性肿瘤。,黄曲霉毒素的急性毒性： 氰化钾的10倍，砒霜的68倍。 黄曲霉毒素的慢性毒性：亚致死量产生慢性中毒，长期接受低剂量导致肝癌。,黄曲霉毒素的存在：玉米、谷物、棉籽、花生、坚果、调味品、草本植物、牛奶中均已发现。,国际上对食品中黄曲霉毒素的限量 （ g/kg),植物药材中黄曲霉毒素

3、的限量,我国原外经贸部WM-2001“药用植物及制品进出口绿色行业标准”中黄曲霉毒素限量为 5g/kg 。 韩国中药材（包括韩药和韩药试用品），黄曲霉毒素B1低于10 g/kg 。 欧美国家将中药定义为“食品添加剂”，所以参考食品中黄曲霉毒素限量标准。,长出黄曲霉的花生,黄曲霉毒素的化学性质,基本结构：二呋喃环和香豆素 分子量为312346 易溶于油、甲醇、丙酮和三氯甲烷，难溶于水，不溶于己烷、石油醚、乙醚。,黄曲霉毒素的化学性质,五种黄曲霉毒素： B1、B2 、G1、G2、M1。 紫外光灯下， B1、B2显蓝色荧光， G1、G2显绿色荧光，黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成

4、的代谢产物。 B1在自然界分布最广，毒性与致癌性也最强。 在中性及酸性溶液中较稳定，耐高温，黄曲霉毒素B1的分解温度为268 。,中药中控制黄曲霉毒素残留量,种子、果实类中药材 发酵类中药材 贮存期中药材、中成药 突发药品、食品安全事件,保证药材质量,为保质期确定提供数据,黄曲霉毒素测定难点,属痕量分析范畴，要求极高的检测灵敏度。 （109，ng/ml） 中药样品种类各异，基体成分复杂。 毒性强，检测风险大。,黄曲霉毒素测定方法,薄层色谱法 酶联免疫吸附法 荧光光度法 HPLC法 柱后碘衍生化荧光检测器（2010版药典） 柱后溴衍生化荧光检测器 柱后光化学衍生荧光检测器（中检所推荐） HPLC

5、/MS/MS,2010版药典方法与中检所推荐方法比较 样品前处理,药典 取样15g（过二号筛） 70%甲醇，高速搅拌 微孔滤膜过滤 过免疫亲和柱,中检所 取样510g（过二号筛） 70%甲醇振荡或超声 离心或微纤维滤纸过滤 过免疫亲和柱,2010版药典方法与中检所推荐方法比较 对照品配制 黄曲霉毒素混合标准品（SUPELCO公司 分别含B1、G1各1g，B2、G2各0.3g）,药典 取0.5ml，甲醇稀释至10ml；再取1ml，甲醇稀释至25ml。,中检所 取1ml，甲醇稀释至10ml；再取1ml，70%甲醇稀释至50ml。,2010版药典方法与中检所推荐方法比较 色谱条件,药典 C18柱 甲

6、醇-乙腈-水（40：18：42） 流速0.8ml/分钟 柱后碘衍生，荧光检测器,中检所 C18柱 甲醇乙腈水 （13.5：13.5：73 20：20：60） 流速1.1ml/分钟 柱后光衍生，荧光检测器,黄曲霉毒素测定,对照品溶液的测定 精密量取黄曲霉毒素混合标准品（SUPELCO公司 分别含B1、G1各1g，B2、G2各0.3g）1ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。 精密量取储备液1ml，置50ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，即得。,对照品溶液配制的注意点： 稳定性 储备液保存在棕色量瓶中，冷藏状态下可保证2个月内稳定，2个月后应考察其稳定性。 溶剂 储备液用甲醇稀释

7、，工作溶液建议使用70甲醇稀释，可得到较好的峰形。,黄曲霉毒素测定,供试品溶液的制备 取供试品粉末5g（过二号筛），精密称定，精密加入70甲醇溶液25ml，超声处理20分钟，离心10分钟（离心速度3500转/分），精密量取上清液5ml，置50ml量瓶中，加70%甲醇5ml，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取25ml，通过免疫亲和柱，流速每分钟3ml，加水5ml洗涤，过空气10秒，略放置后，分次加甲醇1.5ml洗脱，自然洗脱，过空气10秒，氮吹至约0.60.7ml，加水定容至1ml。,注意： 1、样品均匀性 2、滤过要使用微纤维滤纸 3、试剂的纯度,免疫亲和柱净化： 利用抗原抗体免疫反应的原理，使用

8、大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，达到分离净化的目的。,AflaTest P 免疫亲和柱 (美国VICAM),键合在树脂上的抗体,黄曲霉毒素免疫亲和柱,单克隆抗体,杂质,真菌毒素,杂质,真菌毒素与单克隆抗体键合,用水清洗亲和柱,键合在单克隆抗体上的真菌毒素,用甲醇洗脱,甲醇,真菌毒素,甲醇中纯的真菌毒素,亲和柱分离用的泵流操作架,关键参数： 溶液含醇量：低于15，最高不超过20。 取5ml，加70甲醇5ml，加水至50ml,含甲醇约14% 溶液浑浊：影响免疫亲和柱净化 微纤维滤纸滤过 加适量吐温20（最多1ml） 流速

9、 空气干燥问题 免疫亲和柱多次使用,检测,色谱条件：C18柱，流动相为甲醇乙腈水（13.5：13.5：7320：20：60）梯度洗脱，流速1.1ml/min 色谱柱：SHIMAZU VP-ODS（150mm） 进样量1050l 荧光检测器，激发波长365nm，发射波长450nm,黄曲霉毒素分析为什么需要衍生,B1和B2在紫外光下可产生蓝色荧光, G1和G2则产生黄绿色荧光，所以采用荧光分析法。但是 B1 和G1碰到水后，会产生荧光淬灭作用，产生的荧光信号大幅度的减弱，无法实现ppb级的定量检测。,经过衍生和未衍生的黄曲霉毒素的色谱图比较：,检测 柱后光化学衍生,B1,G1光化学衍生法的原理,柱

10、后光化学衍生优点,1 安装调试简单，开机即可用。 2 不需要其它衍生剂，保证了HPLC系统的重现性和使用寿命。 3 通用性，除做黄曲霉毒素，还可以对其它如农药和磺胺等适用。 4 便宜。不到电化学衍生器价格的1半,不到化学衍生设备价格的1/4。,药典中衍生方法：柱后碘衍生 B1, G1碘衍生法的原理,黄曲霉毒素测定过程中的质量控制,线性与校准曲线 随行回收或随行工作对照 空白对照（采用的试剂和水一般要经过特别净化，分析过程中有良好的操作规范，保证不受到环境等污染） 检测限,黄曲霉毒素测定过程中的质量控制,回收率试验 什么时候要做回收率？ 怎么做回收率？,黄曲霉毒素测定过程中的质量控制,实验室首次进行并建立黄曲霉毒素检测方法时，应进行回收率试验。 方法验证回收率 三水平添加，0.5、2（5）、10ppb，每个3份，共9份。 回收率要求70110%,黄曲霉毒素测定过程中的质量控制,每次检测时进行回收率试验 随行回收率 至少做1份限度水平的随行回收率。,黄曲霉毒素测定过程中的质量控制,通过质控样品的测定验证方法的可行性 参加能力测试（盲样测试、比对试验等),黄曲霉毒素测定过程中的安全问题,安全防护 相对独立的试验空间 所有仪器、文具、白大褂等专用 操作过程中全程带手套,黄曲霉毒素测定过程中的安全问题,对照品的使用 购买液体对