细菌内毒素检查法讲义-新乡市食品药品药品检验所

1、中国药典2010年版 细菌内毒素检查法,新乡市食品药品药品检验所 肖健,简况 历史回顾与发展趋势 细菌内毒素 鲎试剂检测内毒素的机理 2010年版药典细菌内毒素检查法介绍,一、简况 一百多年前，在西方医学发展史上，一个最重要的发展就是注射给药（特别是静脉注射）方式的创立。毫无疑问它在人类与疾病作斗争的过程中起了重要作用，但是无论过去还是现在，临床上使用注射剂时经常出现注射引起的发热、头痛、恶心、肤色灰白、昏迷等，甚至导致患者死亡，这些反应总称为不良反应。不良反应可分为热原反应和过敏反应。因此，注射剂的热原检查是保证药品安全的重要检验项目之一。,1912年第一次考虑用家兔做热原试验，1942年美

2、国首先将家兔热原检查方法收入药典。中国药典于1953年开始收载。因此，半个世纪以来，家兔法对保证药品临床使用的安全发挥了重要的作用。但是，随着科学技术和制药工业的发展，这一检查法的局限性越来越明显，所以用新的检验方法代替家兔法检测热原早已成为国内外医药界科研、生产、临床检验等部门很紧迫的问题，基于科学实践发展的要求从而发现并建立了细菌内毒素检查方法。,细菌内毒素试验方法有： 凝胶法（Gelation assay）属限量； 浊度法（Turbidimetrec assay）属定量； 显色底物法（Chromogenic assay）属定量法； 免疫方法（Immumology assay）等。,历史回

3、顾和发展趋势 1、历史回顾 美国是发明鲎试剂和最先建立鲎试验方法的国家。 1956年，美国动物学家F.Bang发表论文鲎的一种细菌性疾病，阐述了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。 1964年，F.Bang和J.levin提出了鲎血凝集的初步机理。 1968年，F.Bang和J.levin建立了鲎试验的方法。 1973年，美国食品药物管理局（FDA）承认鲎试剂为一种生物制品。,1980年，FDA制定了用鲎试剂检查人用和兽用注射药内毒素的准则；美国药典20版（USPXX）收载细菌内毒素检查法（BET），但在药典各品种正文中未涉及。 1983年，USPXX版第四增补本规定了注射用水等5种常用药品和40种放

4、射性药品用细菌内毒素检查取代热原检查。 1991年，USPXX版第五增补本规定185种药品以细菌内毒素检查取代热原检查。,1995年，USPXX版规定471种药品用细菌内毒素检查法检查，保留热原检查的药品不足30种。 1999年，USPXX版规定670种药品用细菌内毒素检查法检查，保留热原检查的药品约20种。 2000年，国际调和委员会使美国药典（USP）、欧洲药典（EP）和日本药局方（JP）达成BET的国际调和案，统一的BET已收载于USPXX和NF19的第二增补本中，并于2001年1月1日生效。,英国、欧洲药典以及日本药局方都已收载细菌内毒素检查法，但规定检查的品种各有不同。一个共同的特点

5、是注射水是最先被允许检查的品种。 中国目前是世界上鲎试剂产量最大的国家之一。 19751982年是我国鲎试剂的研制阶段，当时由于缺乏标准化研究的基础，上千批次的实验结果难于分析。,1983年，卫生部授权国家药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品鲎试验的协作研究。 1988年，卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种药品使用细菌内毒素检查法初检。 1993年，中国药典1990年版第二增补本收载细菌内毒素检查法，但未涉及任何品种正文。 1995年，“中国药典细菌内毒素检查法实施会议纪要”提出争取在35内我国上百种药品由热原检查法改为细菌内毒素检查法。,1996年，中国药典1995年版二部附

6、录收载经修订的细菌内的毒素检查法，注射用水等五种常用药品和九种放射性药品正文规定了细菌内毒素检查，取消了热原检查（其中5%及10%葡萄糖注射液是后来发通知补充）。 1998年，中国药典1995年版1998年增补本收载经重大修订的细菌内毒素检查法，其中对鲎试剂和细菌内毒素检查用水的质量以及细菌内毒素检查方法提出了更高要求。,2000年，中国药典2000年版（二部）新增细菌内毒素检查品种57种，且收载了细菌内毒素检查法应用指导原则。 2005年，中国药典2005年版（二部）新增细菌内毒素检查品种约200种。,2、发展趋势,A.各国药典收载细菌内毒素检查法成为发展的趋势 细菌内毒素检查法作为一种新技

7、术载入药典，成为官方承认的一种法定的药检方法，反映了药典标准水平、药检技术水平的提高，标志着一个国家制药工业水平及药品质量的提高。随着时间的推移，必将有更多国家的药典收载细菌内毒素检查法。,B.细菌内毒素检查取代热原检查成为必然的趋势 细菌内毒素检查法所具有的优点表明它比热原检查法更适应现代制药工业的发展。从USPXX版开始收载细菌内毒素检查法，到USPXX版已有超过90%的注射剂品种规定内毒素检查。其它国家的药典规定细菌内毒素检查的品种同样经历了从无到有，从少到多的过程。可以预见，细菌内毒素检查最终必然会取代绝大多数注射剂品种的热原检查。,C.走向统一的细菌内毒素检查法 USP、EP和JP是

8、三个收载细菌内毒素检查法（BET）较早的药典，它们分别建立了各自的内毒素标准物和BET，WHO为了保持内毒素的国际标准品（IS）的效价（IU）与各国内毒素标准品的效价（EU）的一致性，进行了内毒素IS国际协作研究，自此，内毒素的标准在IU与EU之间实现了统一，即1IU=1EU。虽然内毒素标准初步实行了统一，但在不同的药典方法下测定的内毒素值仍有差别。,细菌内毒素,细菌内毒素是细菌毒素的一类， 是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（Lipoply Saccharide）和微量蛋白（Protein）的复合物，它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡并解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。其

9、化学成分广泛分布于革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、沙门氏菌等）及其它微生物（如衣原体、立克次氏体、螺旋体等）的细胞壁中，其化学成份主要是由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。,类脂A可从O-特异链及核心多糖分离出来，游离的类脂A可自身凝聚成大分子的复合体而难溶于水，并具有生物活性。所以，类脂A（Lipida）是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。该基团没有种属特异性，所以各属细菌的类脂A结构相似，其毒性反应相似。如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血，并导致休克等。 由于类脂A是由4条主链和2条支链的脂肪酸与内酰胺连接组成，所以提纯的内毒素是极为不稳定的。

10、这就要求内毒素应在低温条件下保存，在工作中内毒素稀释应尽可能地缩短时间，并要现配现用。,内毒素具有多种生物活性： 1生物活性：它具有致热性、致死性毒性、白细胞减少、降低血压，休克、激活凝血系统、诱导机体对内毒素的耐受性、鲎细胞溶解物的凝集、刺激淋巴细胞有丝分裂、诱导抗感染的非特异抵抗力、肿瘤细胞坏死作用等一系列生物活性。,2耐热性：细菌内毒素具有很强的耐热性，一般的高压灭菌不能使其灭活，需25030分钟以上的干热灭菌才能使其灭活，目前我国药典热原检查法和细菌内毒素检查法中关于玻璃用具的灭菌处理为25030分钟以上，而日本药局方采用2501小时以上。 其它各国药典也大多如此，国内细菌内毒素标准品

11、的耐热情况虽然未能考察，但可以认为对细菌内毒素检查法中玻璃用具等的除菌最好采用250 30分钟以上的干烤处理。,3外界因素影响：细菌内毒素的生物活性随外界因素的影响变化很大。目前已经知道，一些金属离子、超声波以及温度等都会对细菌内毒素的生物活性产生很大影响，据国外文献报导，铁离子、铝离子等会引起细菌内毒素活性的降低。,因此在试验过程中最好使用玻璃用具，以避免这些因素，另外温度的高低对细菌内毒素水溶液活性影响很大，根据国内外文献报道：内毒素水溶液活性随着环境温度的升高而降低，因此对于内毒素水溶液一定要在低温处保存，而且对已经稀释好的内毒素水溶液，要尽可能的在2小时内用完，以避免活性降低。,鲎试剂

12、检测内毒素的机理,1956年，Bang发现细菌中提取的粗制品能使鲎因血细胞凝集而死亡，而肺炎球菌、葡萄球菌、链球菌的提取物与鲎血细胞无凝集反应。Levin进一步从鲎血变形细胞中提取了几种成分并与提纯的内毒素进行凝集实验的研究，并提出了内毒素的凝胶试验法。,鲎的种属及分布 鲎，又称作王蟹，是一种栖生于海洋中的低等无脊椎动物，大约出现在古生代泥盆纪，距今已明几亿年的历史，但直到现在它的形态并无重大变化故有“活化石”之称，鲎是从古生代的三叶虫演化而来。 鲎的种属很少，目前全世界仅存三属4种： 1. 美洲鲎 Limulus polyphemus LinnaEUs分布在北美西太平洋沿岸 2. 东方鲎Ta

13、chyplEUs tridentatus Leach分布在中国、日本、菲律宾等 3. 巨鲎 TachyplEUs gigas Muller分布在泰国、印度尼西亚等 4. 园尾鲎 Car cinoscorpius rotundi cauda pocock分布马来半岛、印尼等 其中能够用于制备鲎试剂的主要有：1.美洲鲎和 2.东方鲎。,鲎血呈天蓝色，是由于存在能携氧的含铜血蓝蛋白（hemocyanin）所致。鲎血中仅有一种白细胞，又称变形细胞，它含有高密度的颗粒，颗粒中含有与内毒素起凝集作用的酶系统，即凝固蛋白原（Coagulogen）凝固酶原（proclotting enzyme），B因子（fa

14、ctor B）和C因子（factor C）等。,内毒素可使C因子激活，激活的C因子可使B因子激活，激活B因子又可使凝固酶原活化成凝固酶，后者通过酶解作用使凝固蛋白原转变为凝固蛋白（coagulin）。凝固蛋白又通过交联（crosslinking enzyme）作用，相互聚合而形成纤维状的凝胶。,2010年版药典细菌内毒素 检查法介绍,整体结构 1. 综述部分 检查法的描述 试验的准备 限值（L）的确定 确定最大有效稀释倍数（MVD） 2. 实验部分,凝胶法 光度测定法 a 鲎试剂灵敏度复核 a 标准曲线的可靠性实验 b 干扰实验 b 干扰实验 c 检查法：限量试验 c 检查法 半定量试验,综述

15、部分,1. 检查法的描述 2. 试验的准备 3. 限值（L）的确定 4. 确定最大有效稀释倍数（MVD）,本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。,检查法的描述,细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度 法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素标准物质 a 国家标准品 b 工作标准品 细菌内毒素检查用水 a 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌 注射用水 b 光度测定法细菌内毒素检查用

16、水，其内毒素含量应小于0.005EU/ml,试验的准备,试验器械的要求 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250 干 烤至少30分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。 若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。,试验的准备,供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。 一般要求供试品溶液的pH值在6.08.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推

17、荐的适宜的缓冲液调节pH值。 缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。,限值（L）的确定,药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）除药典有规定的，一般按以下公式确定： LKM L为供试品的细菌内毒素限值；以EU/ml、EU/mg或EU/U表示； K为规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素量；以EU/（kgh）表示。注射剂，K=5EU/（kgh），其中放射性药品注射剂，K=2.5EU/（kgh），鞘内用注射剂，K=0.2EU/（kgh）； M为人用每公斤体重每小时最大剂量；以ml/（kgh）、mg/（kgh）或u/（kgh）表示，人均体重按60kg计算，注射时间小于1小时，按1小时计

18、算 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。,计算举例：注射用阿莫西林钠 根据国家药典委员会编纂的临床用药须知：“肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次0.51g，一日34次：小儿按体重每日50100mg/kg，分34次静脉滴注。” M成人1000mg/h60kg16.67mg/(kgh) M儿童100mg/(kgh)333.3mg/(kgh) L=K/M=5EU/(kgh)33.3 mg/(kgh)=0.150EU/mg,限值（L）的确定,限值计算时做必要调整的几种情况 从严原则 联合用药 特殊情况等,限值（L）的确定,确定最大有效稀释倍数（MVD）

19、,最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。 MVDcL L：供试品的内毒素限值 c：供试品溶液的浓度 ：在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)， 或在光度测定法中所使用的标准曲线上最 低的内毒素浓度(如标准曲线为50、5、 0.5EU/ml三个浓度组成),计算举例 a 当L以EU/ml表示时，则浓度C的单位为1.0ml/ml 适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应 小于xx EU/ml。 例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用 灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，则： MVD1.0ml/ml0.5EU/ml

20、0.125EU/ml4倍,确定最大有效稀释倍数（MVD）,计算举例 b 当L以EU/mg表示时，则C的单位为mg/ml或U/ml适用于供试品为固体状态，如粉针；或液体但是规定限值为应小于xx EU/mg或EU/U。 例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。 需先称取一定重量的注射用阿莫西林钠，在已除去外源性内毒素的容器中，用细菌内毒素检查用水配制成一定浓度的溶液。 如称取100mg注射用阿莫西林钠，用5ml内毒素检查用水溶解，即成为浓度为20mg/ml的阿莫西林钠溶液。 MVD20mg/ml0.15EU/mg0.125EU/ml24

21、倍,如果供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1，计算供试品的最小有效稀释浓度c=/L ； 适用于供试品为固体的情况。计算得到的最小有效稀释浓度即为MVD下的该供试品的浓度。 例：注射用阿莫西林钠 计算限值为0.15EU/mg，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度 c 0.125 EU/ml0.15EU/mg0.833mg/ml,例：注射用青霉素钠（规格：80万单位） 限值为0.01EU/100u，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验。 最小有效稀释浓度 c 0.25 EU/ml 0.01EU/100u 2500u/ml,实验部分,目的 考察鲎试

22、剂的灵敏度是否准确 考察检验人员操作方法是否正确 实验条件是否符合规定 何时进行 使用新批号的鲎试剂 试验条件发生可能影响检验结果的改变时,鲎试剂灵敏度复核试验,鲎试剂灵敏度复核试验,鲎试剂灵敏度复核试验,放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；形成的凝胶不坚实、变形或从管壁滑脱者为阴性； 保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,结果判断：若最大浓度2管均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管阴性，试验方有效。 结果计算：反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值 c=l

23、g-1(X/4) 式中X为反应终点浓度的对数值（lg）。 （反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。）,鲎试剂灵敏度复核试验,鲎试剂灵敏度复核试验,当c在0.52（包括0.5和2）时，方可用于细菌内毒素检查。 实验时，以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,鲎试剂灵敏度复核试验,凝胶法干扰试验 目的：是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。,试验操作： 在干扰试验中，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，即与所使用的鲎试剂反应，不出现阳性的供试品溶液。,凝胶法干扰试验

24、,凝胶法干扰试验,当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。（注：须三个批号以上的供试品，两个以上鲎试剂厂家的试剂） 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。如：内毒素检查时，供试品阳性对照为阴性时。,目的：初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU/mg或EU/U活性单位表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU/ml表示），为正式干扰实验提供依据； 优点：减少摸索过程、节省成本。,预试验,操作步骤： 将供试品溶液进行一系列倍数的稀释； 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验，每一稀释倍

25、数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即含2.0浓度标准内毒素的该浓度的供试品稀释液）； 另做2支阴性对照和2支阳性对照。,预试验,预试验结果判断： 当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效； 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数，即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。,预试验,正式干扰试验,目的：检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。 操作：用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品分别制备一系列浓度的内毒素溶液。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。,结果判断,

26、当供试品阴性对照A和阴性对照D都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效。 分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用供试品溶液和稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）； ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4) 当ES在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5ES 2 ES（包括0.5 ES和2 ES）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。,当存在干扰时，可通过对供试品进行更大倍数的稀释或有关其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。,检查法凝胶法,凝胶限量试验 凝胶半定量试验,凝胶限

27、量试验,检验供试品中的内毒素含量是否小于限度的定性方法。,例：替硝唑注射液，计算限值为0.5EU/ml，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行检验，计算： MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml4倍 供试品溶液：4倍替硝唑稀释液 供试品阳性对照为：含0.25EU/ml标准内毒素的4倍替硝唑稀释液 阳性对照为：浓度为0.25EU/ml的标准内毒素溶液,凝胶限量试验结果判断,凝胶限量试验结果判断,凝胶限量试验结果判断,复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均 为阴性，判供试品符合规定；四管中如有一管为阳性， 即可判供试品不符合规定。,凝胶半定量试验,半定量试验是使

28、用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法，系通过反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。 原理：通过供试品系列稀释液与鲎试剂反应，其反应终点浓度的稀释倍数与鲎试剂灵敏度的乘积即为供试品的内毒素含量。,凝胶半定量试验,操作：用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度和稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8倍的稀释液，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。,凝胶半定量试验溶液的制备,凝胶半定量试验结果判断,当阴性对照溶液D的平行管均为阴性； 供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性； 系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间，则试验有效。 若内毒素浓度小于规定的限度，判供试品符合规定

29、。 若内毒素浓度大于或等于规定的限度，判供试品不符合规定。,凝胶半定量试验结果计算,例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值为0.5EU/ml； 通过使用3个鲎试剂厂家的鲎试剂对3个不同厂家的7个样品进行干扰试验证实：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀释2倍后即不干扰内毒素检查； 使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂对一批右旋糖酐20葡萄糖注射液进行凝胶半定量试验。 MVD0.5EU/ml0.03EU/ml16.67倍 从已确定不干扰的稀释倍数2倍起，再进行1、2、4、8倍稀释(相当于将供试品原液进行了2、4、8、16倍稀释，最终的稀释倍数没有超MVD)。,如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。 由于检验时采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干扰稀释倍数2倍稀释液，因此计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数2； 原右旋糖酐20葡萄糖注射液中内毒素含量为： 20.0849EU/ml0.170EU/ml,如试验中供试品溶液的结果均为阴性，应记为内毒素浓度小于（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于乘以该供试品的最低稀释倍数）。,如试验中供试品溶液的结果均为阳性，应记为内毒素浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以 。,检查法光度测定法,标准曲线的可靠性实验,当使用新