基因表达载体的构建69830.ppt

1、1.第六章：外源基因在大肠杆菌中表达的调控；第一节：基因表达的概况和基本条件；第二部分：基因表达的概况和基本条件；第一节：基因表达的基本概念；第三部分：真核基因在原核细胞中的表达和调控；第三部分：影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素。1.启动子结构对表达效率的影响。表达载体3的选择。密码子在外源基因中的作用。mRNA 5的一级结构和基因表达。mRNA二级结构对翻译起始的影响。转录终止区对外源基因8表达效率的影响。转录后某些因子与基因表达的关系。宿主选择对表达10的影响。培养条件的控制对表达效率的影响，4，1，基因表达的基本概念，生物体的遗传信息以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质的DNA中，而基

2、因表达是指靶基因的DNA在导入的细胞中转录成信使核糖核酸，然后在信使核糖核酸的指导下翻译成蛋白质。基因表达依赖于有效转录的调控、mRNA的正确翻译和翻译后的加工，其中转录是最关键的，原核细胞中基因表达的过程和模式与真核细胞中的明显不同。5，2，基因表达的基本条件，1。外源基因插入序列必须保持正确的方向和阅读框架。遗传密码不应丢失、遗漏、错位或错误。否则，会导致蛋白质分子编码错误，特别是目标基因序列不应含有酶消化位点两端的识别序列。2.插入的外源基因必须置于原核启动子的控制之下，这意味着原核核糖核酸聚合酶可以识别插入的基因。3.外源基因必须在大肠杆菌中被有效转录(例如，不含内含子)，并且转录的信

3、使核糖核酸必须在细菌中非常稳定并且能够被有效翻译，并且翻译的蛋白质分子不会被细菌中的细菌蛋白酶降解。6、3。真核基因在原核细胞中的表达和调控。真核基因在原核细胞中的表达和调控特点：(1)有效转录及其调控元件；(2)正确翻译；(3)原核表达载体的构建；(7)有效转录及其调控元件；(1)核糖核酸聚合酶；(2)启动子的启动及其转录(启动子的概念和分类)；(3)转录终止；4)转录减弱；(8)、(ii)正确翻译，1。起始密码子(起始)，2。核糖体结合位点(RBS，也称为SD序列)，9，(iii)原核表达载体的构建，原核表达载体的构建要求1。表达载体类型2。表达载体3的例子。包涵体表达载体，10，启动子，

4、(1)乳糖启动子(lac) (2) Trp启动子(3) tac启动子(4)P1和pr启动子(5)噬菌体脂蛋白启动子(lpp)，11，启动子-35区和-10区序列与一般转录序列一致，它们之间的距离为17 bp，当大于17bp时效果差。为不同的产物选择不同的启动子，例如尿激酶的PTA和il2/2fu-。12，表达载体的选择，载体的分子量不能太大，最好是2.5-5.6kb，具有高拷贝，不同产品应选择不同类型的表达载体。13，密码子在外源基因(cDNA)中的作用，基因在细菌中的表达优先选择密码子，而稀有密码子(AGA，AGG)的表达效果不佳，特别是当有AGA-AGG连续序列时，14，mRNA一级结构与

5、基因表达，起始密码子：表达效率AUGGUGUUG SD序列：长效率，如UAAGG。SD序列与AUG的距离一般为6-12bp，4-10bp最好，9bp最好。如果有5-UGAUCU，可以增强SD序列的5非翻译区。15，二级结构对翻译起始的影响。当信使核糖核酸形成二级结构时，可以产生茎环。如果SD序列和AUG位于茎环或发夹中，翻译被抑制；茎环外，有利于翻译。见表6-1，16，对信使核糖核酸稳定性的影响，REP序列可以防止信使核糖核酸降解，而偏爱密码子也起保护作用。，17，真核基因在原核细胞中的表达和调控，只有一种核糖核酸聚合酶以操纵子为单位完成基因转录，没有核糖核酸剪接功能，因为没有核仁和核膜，而且

6、核酸都暴露在外，转录和翻译是多核糖体上转录产物的连续合成，同时，许多合成的肽链具有独特的SD序列，它们调控着核糖核酸和核糖体的有效结合和翻译的初始非糖基化功能。18，核糖核酸聚合酶，原核细胞中只有一种核糖核酸聚合酶，只有当其核酸酶与因子结合形成全酶时，它才能识别脱氧核糖核酸上的启动子进行转录。19，启动子的概念是一种位于结构基因上游的DNA序列，对于转录起始的调节是必需的。它包含-35区(结合因子)和-10区(结合核酸酶)的保守序列。当启动子与整个酶结合时，转录可以从转录起点1开始，如图6-1所示。20，转录的终止是由转录终止子起作用的，而能终止转录的相关DNA序列称为终止子。强终结器：它不依

7、赖于因子来扮演终结的角色。回文序列中有许多G/C对，有四个以上的U，导致RNA聚合酶的构象变化，终止转录。如图6-9所示，如图6-10所示，弱端接取决于端接的因子。如图6-11，21所示，转录的减弱，使得转录中途停止而没有到达停止信号，使得mRNA转录部分停止，但不是完全停止。22，起始密码子，即编码多肽链第一个氨基酸并编码甲硫氨酸的密码子AUG(或ATG)。细菌中还有一个罕见的起始密码子GUG，它编码缬氨酸。AUG的初始表达函数 GUG。23，核糖体结合位点，序列(RBS)，其存在于转录的mRNA的AUG上游，并且是与核糖体有效结合和翻译所必需的，其长度为3-9bp，距AUG3为3-11bp

8、。它与16s rrna(auuccac-Dag-5)的3端互补，其互补程度、SD与aug之间的距离与翻译效果有关。如图6-15所示，有四种类型的表达载体：非融合表达载体，如PKK223-3，分泌表达载体，如PIN -OMPA 1，融合蛋白表达载体，PGEX，如包涵体表达载体，如pBV220，如图6-17，25，原核表达(图6-13)也应结合考虑：质粒的复制能力和稳定性，翻译蛋白(分泌/包涵体/融合蛋白)的表达形式和储存位置，分子量，性质，26，乳糖启动子(lac)，当乳糖不存在时，调节基因(I)产生阻遏蛋白与操作基因结合，阻止核糖核酸聚合酶结合，然后阻止转录；在乳糖的存在下，乳糖可以与阻遏蛋白

9、结合，并使其变构解离以执行转录功能。如图6-2所示，LacZ基因可以被IPTG转录(异丙基硫代-D-半乳糖)。Lac启动子的重组如图6-3、6-4 (a) (b)和27所示。当Trp启动子和Trp启动子含有色氨酸时，阻遏蛋白相互结合，阻遏蛋白变构激活并与启动子结合以阻止核糖核酸聚合酶转录。当色氨酸不存在时，阻遏被释放，因为-吲哚乙酸是色氨酸的竞争性抑制剂，通常被用作诱导色氨酸启动子转录的诱导剂。(见图6-5)同时，衰减器也调节Trp转录(见图6-6)。28，tac启动子，Tac启动子是由Trp启动子和Lac启动子构建的杂交启动子，-35区是Trp启动子序列，-10区是LacUV5启动子序列，它们之间的距离是pTrc和pTac。启动子只需要IPTG来诱导转录。如图6-7、图29所示，噬菌体的磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇启动子，磷脂酰肌醇是 左启动子，磷脂酰肌醇是右转录启动子，它可以通过与磷脂酰肌醇阻遏物结合来抑制磷脂酰肌醇或磷脂酰肌