微生物学实验基本操作与培训.ppt

1、一、1、微生物基本实验操作技能的要领和注意事项，一、2、1、无菌操作，1、无菌概念：哪里有细菌，哪里就有无菌；要求基本无菌和严格要求无菌的地方。2.操作环境：实验室；接种箱；干净的长凳；无菌工作室。3.工作范围：接种、试管转移、平板倒置、梯度稀释、平板涂布、平板划线、菌体(细菌悬液)转移及其他需要无菌操作的实验环节。a，3，1。无菌操作，4。要点及注意事项：(以实验室接种和转移为例)(1)斜面接种环法；(2)火焰保护；(3)接种环消毒；(4)冷却孕育环并轻轻接触斜面；(5)棉塞的生产和处理。a，4，2，染色压片，1，类型：分装片剂和涂片；2.操作步骤：(以涂片为例)1)涂片：载玻片-滴生理盐水

2、-挑菌并涂成膜；2)干燥：室温下自然干燥；3)固定：将细菌面朝上，通过火焰2-3次；4)染色：滴加染液(亚甲蓝)并覆盖2-3分钟；5)水洗：用自来水洗涤至基本无色，晾干；6)显微镜检查：调整光源，用低倍显微镜、高倍显微镜和油显微镜观察。a，5，2。染色并制成片剂，4。要领和注意事项：(1)不得有过量的生理盐水和细菌；(2)细菌膜不应太厚，最好以致密的方式分布细胞；(3)固定应到位，无残留水，无过度固定；(4)染色时间正确，必须按规定定时；(5)洗涤时，水流不应太急；(6)显微镜检查前，薄膜必须干燥无水。a，6，3。油透镜的使用，1。工作范围：观察大小相似的细菌和微生物，真核微生物的细胞器。2.

3、使用特点：一定要用油；操作要求很高。a，7，3。油透镜的使用，3。要领和注意事项：(1)所用的胶片和涂片必须无水；(2)用低、高倍镜观察选择视场，将待观察目标调整到视场的右中心；(3)注意保护镜头和胶片，从侧面观察镜头进入油系统；(4)观察油透镜时，使用微调来调整焦距，始终根据镜子和胶片的分离方向使用微调来调整焦距；(5)焦距调节速度必须慢，以避免焦虑，因为图像的焦距范围很小；(6)注意光线的强度；(7)擦拭透镜，并在薄膜上涂上溶剂(二甲苯)。a，8，4，革兰氏染色，1。工作范围：细菌学中最重要的差异染色方法之一，也可用于其他微生物的鉴定。革兰氏染色对于微生物形态的一般观察是不必要的。2.基本

4、步骤：1)一次染色：结晶紫染色；2)媒染：碘溶液媒染；3)脱色：乙醇脱色；4)复染：藏红花复染；一、9、4、革兰氏染色，三、要点及注意事项：1)菌株的菌龄应选择生长旺盛期的典型菌；2)生产，根据单一染色的基本要求；3)乙醇脱色时间是本实验成功的关键。注意白色背景，用95%的乙醇清洗，直到变成紫色，大约20-30秒，然后立即用水冲洗掉乙醇；4)观察时，应以分散细菌的颜色为准。5)对未知细菌进行革兰氏染色时，应选择两种不同形状、不同染色结果的已知细菌，并与未知细菌混合压片染色。细菌、放线菌、酵母和霉菌形态的差异：(1)细菌和放线菌是原核生物，而酵母和霉菌是大小不同的真核生物；(2)放线菌和霉菌是丝

5、状的，而细菌和酵母是非丝状的；(3)霉菌具有孢子柄和子实体等特殊形态，而放线菌没有。(4)注意提问，不要把它们理解为群体形式。a，11，VI。用血细胞计数板计数微生物数量。1.工作范围：这种方法计算死细菌和活细菌的总数，所以它被称为细菌总数2)计数室显微镜检查：计数前，用显微镜检查计数板的计数室。如果有灰尘，请清理干净。3)加样：盖上盖玻片，用毛细管从盖玻片边缘滴一小滴菌液，让其自行渗入计数室。没有气泡。4)显微镜计数：五分钟后，寻找低镜计数室，然后用高镜计数。一般来说，建议每个细胞有5-10个细菌。经常选择四个角和中间的五个正方形来计数。在网格线上，只计算上面的线和左边的线。芽比亲本的一半大

6、。在同一个房间里。5)清洗血细胞计数板：用自来水冲洗，不要用硬物冲洗，自己擦干。显微镜检查，直到清洗。a，12，6。用血细胞计数板计数微生物数量，3。要点和注意事项：(1)计数结果为微生物总数，包括死菌和活菌；(2)将细菌悬液摇匀；(3)计数网格的数量和分布应合理；(4)压线和出芽处理；(5)细菌悬液的稀释应适当，不要太浓或太稀；(6)光线应适中(特别是不要太强)，否则将找不到计数室；(7)先低功率镜，然后高功率镜。a，13，VII。微生物大小的测定，1。工作范围：原核微生物的测定一般采用油透镜；真核微生物的测定通常用高倍显微镜进行。千分尺主要用于测量细菌和酵母，但放线菌和霉菌较少。2.操作步

7、骤1)目镜测微计的校准(1)放置目镜测微计：测微计刻度向下；(2)放置镜台的千分尺：千分尺的刻度朝上；(3)目镜测微计的校准：按照低、高、油的顺序，两对刻度线在两个测微计的一定间隔内完全重合，计算如下：两对重合线之间镜台上的测微计刻度数为10，每一个目镜测微计小刻度的长度(m)=335433333333333333333333333333333333333-目镜在两对重合线之间a，14，7。微生物大小的测量，3。要领及注意事项：(1)显微镜台秤的刻度必须朝上；(2)目镜测微计的刻度向下，并置于目镜和透镜之间；(3)根据低、高、油顺序校正目镜测微计；(4)两对刻度线应完全重叠；(5)当镜台千分尺

8、的线太粗时，可以与线的同一侧对齐。(6)测量细菌等原核生物时，应严格按照油镜的使用要求操作油镜，并应特别注意光强。(7)少于一个网格的值的判断必须尽可能准确，不能马虎；(8)注意各种微生物的大小。如果计算结果与理论值之间有很大的差距，则应进行检查。a，15，8。斜面、平板和摇瓶的制造。1.工作范围：斜面；菌种培养和保藏；平板：微生物分离、纯化和活菌计数；摇瓶：微生物液体培养，模拟发酵罐。2.操作步骤：1)根据培养基配方称取各种药物和试剂；2)按要求称取斜面和平板上的琼脂，摇瓶不加琼脂；3)溶解：加入比所需量少的水，用玻璃棒搅拌均匀，加热电热套溶解。加入琼脂，加热，搅拌溶解，补充水至所需总体积；

9、4)调节酸碱度：测量酸碱度，用滴管向培养基中加入氢氧化钠或盐酸，边测量边调节至所需的酸碱度范围；a，16，8。斜面、平板和摇瓶的制造；5)分装：将准备好的培养基放入试管和三角瓶中(250毫升)，试管为1/4。6)塞：在管口(瓶)上放一个棉塞，既能保证通风，又能防止微生物进入外边界造成污染：用八层纱布覆盖瓶口；7)捆扎8)消毒9)搁置斜面：放置棉签a 17 8。斜面、平板和摇瓶的制造。3.要领及注意事项：1)注意称量各种药物和试剂的准确性；2)微生物培养的培养基一般用自来水配制；3)斜面上的琼脂应彻底溶解；4)不要忽略酸碱度调节(除了“自然”)；5)分装后的培养基应使用培养基分装装置(移液管、玻

10、璃漏斗)进行分装，培养基不得沾在管(瓶)口；6)倒平板时，注意避免烫伤手。a，18，9。消毒，1。操作步骤：1)通电，打开开关，观察指示灯，根据状态加水；2)放置消毒物品；3)设定温度和时间(121，20分钟)，通电加热；4)完全排空冷气，关闭排气阀；5)杀菌后，切断电源，自然将锅内温度降至0，打开排气阀。6)取出灭菌后的培养基和物品，自然冷却，沥干水分。一、19、9、灭菌，2、要领及注意事项：1)一定要检查水位；2)温度和时间设定方法应按照规范要求操作；3)排出冷空气是关键，必须了解原理；4)蒸发一段时间后，取出已灭菌的培养基和物品；5)大胆、小心，注意安全。a，20，10，敷料，1，试管：一捆几个试管，用一层牛皮纸包着的棉塞；2.三角瓶：棉塞用一层牛皮纸包裹，防止冷凝物弄湿棉塞，并用绳子捆绑；3.移液管：将棉花放在嘴上，包装报纸；4、培养皿：6-7套，用报纸包裹