流式细胞仪的原理与应用课件

1、Flow cytometry，1，学习通信PPT，flow cytometry，FCM是20世纪70年代开发的，是一种用于快速测量、分类和收集细胞物理或化学特性(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)的先进技术，概述，2，学习通信PPT，流式细胞术(FCM)通过荧光显微镜技术获得，同时利用计算机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学等多种先进技术的发展，将荧光显微镜的刺激光源变成激光，通过更好的单色和激发效率，大大提高检测灵敏度，将固定标本台变成流动的单细胞悬浮，3学习交换PPT、流式细胞术(FCM)具有细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学和临床检验

2、学等基础研究和临床实践各方面广泛使用的快速、灵活、大量、敏感和定量的特性，在所有领域发挥着重要作用。4，学习交换PPT，流式细胞术是快速测定细胞物理或化学性质的高技术。使用流式细胞术快速、直线、流动状态下单细胞或生物粒子的多参数快速定量分析，同时对特定群体进行分类的现代细胞分析技术。比传统的荧光显微镜检查更快、准确度更高、准确度更高等成为当代最好的细胞定量分析技术。5学习交流PPT，国内使用的流式细胞术主要是美国两家制造商的： BECKMAN- COULTER的Becton-Dickinson (B-D)流式细胞术，主要有两种类型的：临床(小型机器，也称为台式机)合成型()，6，学习通讯PPT

3、，流式细胞术的原理和应用，1-流式细胞术的原理2-流式细胞术在生物医学中的应用，7，学习通讯PPT，流式细胞术的研究对象是各种细胞、微生物和人工合成微球等生物粒子，包含各种物理和生物特性，1973年世界第一大企业流式细胞术face 通信PPT，流式细胞术的工作原理测试中的样品是单细胞悬浮，通过特定荧光染料染色细胞(或表面抗原等)，然后放入上管，在清洁气体的压力下，将要测试的样品压入移动室。 与此同时，无细胞磷酸盐缓冲液(鞘)在高压下从鞘管中喷出，鞘入口方向与正在测试的样品呈一定角度流动，鞘溶液绕着样品高速流动，流式细胞术一般使用激光作为发光体。集中在成型的光线上，然后垂直于样品流照射，荧光染色

4、的细胞在激光束的照射下产生散射和激发荧光。9，学习通讯PPT，前角散射，即FSC与细胞直径正相关，因此我们通常在操作机器时排除FSC的阈值，碎片和其他粒子，避免干扰。侧角散射，即SSC，是与激光束正交的90度方向的散射信号，对细胞膜、细胞质和核膜的折射率更敏感，可以提供有关细胞内结构和粒子特性的信息。两种信号同时由全方位光电二极管和90方向的光电倍增管接收。全方位光散射信号基本上是以反映细胞体积大小的前小角度检测的。荧光信号的接收方向垂直于激光束，经过一系列双色反射镜，经过带通滤波器的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这种荧光信号的强度表示所测量的细胞膜表面抗原的强度，或其核内物质的浓度。10

5、，学习交换PPT，流式细胞术将被测试细胞放入样品管，在气体压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘内的约束下，细胞排成一行，从移动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。从流动的液体中取一个排列成单列的细胞，获得该细胞的光散射和荧光指标，分析其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理和化学特性。11，学习通信PPT，12，学习通信PPT，鞘的作用2:一是限制在喷嘴中心的样本，以提高测量精度；二是确保样品接近孔壁，不堵塞孔。在这个约束下，细胞排成一行，从鞘包下的流动室下的喷嘴中心喷出，形成微型导管柱。液晶与入射的高度集中激光束相交。这时细胞的荧光染料受到刺激，产生特定的荧光。建立了荧光测量系统，将细胞的荧光

6、信号垂直于入射激光、液晶、滤光器、探测器等入射激光和液晶，并通过专用软件进行分析。13，学习通讯PPT，流式中心由单列匀速运动粒子组成的液体柱，14，学习通讯PPT，还选择其他单克隆抗体和荧光染料，我们可以使用FCM同时测量一个细胞的多个不同特性；如果你对某些特性的细胞感兴趣，我们也可以利用流动分类功能对它们进行分类，进一步培养和研究。15，学习通讯PPT，应用领域，所有能显示为路西法的细胞或粒子都可以用流式细胞术检测。这个路西法可以被由流式细胞术构成的激光光源激发的前提是在生物检测技术中，流式细胞术是无数的机械装置。16，学习通信PPT，流式细胞仪是在单个细胞或其他生物粒子的功能级别进行定量

7、分析和分类的检测手段，每秒可以分析数万个细胞，同时在一个细胞中测量多个参数。它的复盖范围很广，而且还在不断增加。当然，细胞分类也是重要的应用之一。它可以根据每个细胞的光散射及荧光特性，将特定细胞从细胞群中分类。一次一个细胞。所以流式细胞术是荧光激活细胞分类器(fluorescence-activated cell sorter，FACS)，17，学习通信PPT，流式细胞术，单细胞悬浮或生物粒子，分析速度，多参数，高精度，高精度流式细胞术分析速度：普通流式细胞术每秒检测3000到6000个细胞，大型机每秒能达到数万个细胞。2.流式细胞术的荧光检测灵敏度：一般可测定单个细胞内600个荧光分子，分为

8、两个细胞间荧光差异 5%。3.前角散射(FSC)检测灵敏度：前角散射(FSC)反映了测量的细胞大小，一般流式细胞仪可测量到0.2 m到0.5 m。流式细胞术主要技术指标，20，学习交换PPT，4。流式细胞术分辨率：这里的分辨率与其他地方的解释相差太大。通常，“分辨率”表示每个方向的像素数，分辨率越高，图像越清晰。其中分辨率是FCM装置测量精度的指标，通常用可变系数CV表示。使用流式细胞术测量具有完全相同内容的采样组时，CV值越小，曲线分割越窄，集中程度越高，测量误差越小，分辨率越高。典型的FCM在最佳状态下为CV2%。在测量标本之前，用荧光微球调整仪器是必须达到的要求。5.流式细胞术分类指标：

9、分类指标主要包括分类速度、分类纯度和分类产率。分离速度表示FCM每秒从液体中提取的细胞数。分类纯度表示选定细胞中目标细胞所占的比例。分离产率除以其在原始溶液中的细胞比例，表示选定的细胞。21，学习交换PPT，2流式细胞术基本结构，光学系统流系统电子系统数据处理系统分类系统，19，特定荧光染色细胞需要适合发射荧光进行收集测试的光源照射刺激。光源的选择主要取决于激发物质的激发光谱。FCM的光学系统由一组透镜、过滤器、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号发送到不同的电子探测器。细胞要均匀照射，提高分辨率，照射到细胞的激光光斑直径必须与细胞直径相似。因此，激光束必须通过透镜收敛。为了使检测到的发射荧

10、光更强，并提高荧光信号的信噪比，光路中也使用了多种过滤器。带阻或带通过滤器有选择地过滤或通过特定过滤器段的光线。例如，525纳米带通滤波器只能通过FITC(Fluoresceinisothiocyanate，isothicynofluorescein)中的525纳米绿光。长波(短)通过各向异性反射镜，仅通过一个波长以上(下面)的射线，反射此波长下其他特定波长的射线。在免疫分析中，通常同时检测两个或多个波长的荧光信号，使用双色镜或双色光谱仪有效地分离各种荧光。，流式细胞术光学系统，23，学习AC PPT，FACSCalibur流式细胞术，24，学习AC PPT，我中心检测流式细胞仪：bdfacs

11、 calibbur激光：488nm，633nm公共荧光标记：FLLCFSEFITCAlexa flouro 488 fl2:PE；pi fl3:7-aad；PE-Cy5；PerCPPerCP-cy 5.5；PE-cy 5.5；PE-cy7 fl4:APC；Alexa Flouro 647常规检测项目：凋亡检测细胞周期检测细胞内活性氧检测细胞表面标记检测细胞内因子检测，25，学习交流PPT，激光(Laser)荧光素和荧光素检测信号参数，26，学习AAS 28，学习AC PPT，常用fluorescein，Fitc fluorescin iso thiocy anate PE phycoeryth

12、roin percp peridinin chorophyl proein APC allophycocyaning 波长比入射光长的光量子荧光抗体和细胞抗原的结合越强，产生的荧光信号越强，学习31，AC PPT，启用双激光三维空间激励系统，双激光，两点激发，四色荧光信号间补偿最小化的四色荧光分析，提高检测灵敏度双激光的应用大大扩大了染料的选择范围。 因此，仪器的应用领域也在扩大，学习32，AC PPT，细胞携带PE和FITC等两个荧光素，被激光刺激发射两个不同波长的荧光时，理论上，可以选择过滤器，使每个荧光灯只能由该探测器检测，不检测其他荧光。但是，现在使用的各种荧光染料是宽发射光谱特性，因

13、此，虽然各峰不同，但发射光谱范围稍有重叠，FITC探测器检测到的PE光谱较少，PE探测器检测到的FITC光谱较多。克服此误差的最有效方法包括荧光校正电路、光谱重叠校正、33、学习交换PPT、34、学习交换PPT、流式细胞仪能检测的细胞参数、1前角散射(FSC):前角散射光的强度与细胞的大小有关。也就是说，同一个细胞群体，FSC强，那个细胞大，FSC弱，那个细胞小。2 SSC(横向角度散射):横向角度散射，也称为90度散射或大角度散射。侧角散射光对细胞膜、细胞质和核膜的折射率更敏感，对细胞内更大的粒子也有反应。因此，侧角散射光的强弱可以反映细胞内的微观结构和粒子的性质。35，学习通讯PPT，3荧光强度(FL):细胞或细胞的荧光染料是激光激发后释放的荧光，其他荧光染料的发射波长不同。荧光强度区分同一细胞群中具有荧光标记的细胞和没有荧光标记的细胞。也就是说，通过将我们通常称为阳性细胞的阳性细胞和阳性细胞内高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，可以区分强阳性细胞和弱阳性细胞。典型的流式细胞术中只有一个激光光源(488nm、633nm、325nm)测量3个FL，即FL1、FL2、FL3，可以测量4个或6个FL。，36，学习通信PPT，前角散射(FSC，Forward Scatter)细胞