基因组DNA提取与PCR技术ppt课件

1、.,基因组DNA提取与PCR技术,李兆阳,.,前言,在基因工程和蛋白质工程中，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。,.,主要内容,基因组DNA提取 1、核酸的分类及理化性质 2、几种核酸提取方法的基本原理及实 例分析 3、常见问题与对策,.,核酸分为两大类,脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。,.,脱氧核糖核酸（DNA）,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大 DNA结构,.,核糖核酸（RNA）,

2、RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。,.,核酸的理化性质,RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,.,核酸的理化性质,天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，

3、先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。,.,核酸的理化性质,DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时， 常用此法分离这两种核蛋白。,.,DNA提取的几种方法 (1).浓盐法,利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯

4、化钠提取液抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积无水乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. 也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异戊醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.,.,（2）阴离子去污剂法,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸,.,基因组DNA-SDS法,以动物组织为例,.,（3）苯酚氯仿抽提法,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降

5、解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 .,.,（4）水抽提法:,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积无水乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用70%、80%和95%乙醇洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.,.,几种方法的比较 苯酚、氯仿抽提/醇沉淀方法,

6、是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便 。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。 关键 ：酚氯仿要混匀彻底，用量足够。,.,浓盐法,高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与酚氯仿抽提方法相比，纯度的稳定性可能要低一点。 更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提。 不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。,.,水沉淀,此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.,.,实例分析,从鼠尾组织中提取基因组DNA,.,弃上清,12000rpm 10min,12000rpm 10m

7、in,12000rpm 10min,4度保存,PK、SSTE 55度,流程图,.,DNA中含有蛋白、多糖、酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶切和PCR反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发后再溶解。 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。,原因,对 策,.,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的

8、DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于TE缓冲液中，避免反复冻融,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,对 策,原因,.,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料适当增加用量. 高温裂解时,时间适当延长，适当增加PK的用量。 低温沉淀,延长沉淀时间 注意动作轻柔,避免丢失。,DNA提取常见问题,问题三：DNA提取量少。,对 策,原因,.,DNA电泳图,.,PCR技术,1、PCR发展历史 2、PCR原理及引物设计基本原则 3、常见问题与注意事项 4、PCR技术的发展,

9、.,PCR发展历史,PCR的设想 本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆目的片段”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件-模板DNA,引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系;DNA变性、复性及延伸的温度与时间。,.,一、PCR的基本原理,DNA的复制 (replication) 由亲代

10、DNA合成两个相同的子代 DNA的过程。,.,基本原理：,在模板、引物、4种dNTP和Taq DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。,.,基本步骤,变性：加热使双链DNA变为单链 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应,.,一、PCR的基本原理示意图,Flash演示,.,二、PCR引物设计 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。 其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。,.,1、引物长

11、度一般为1530个核苷酸。 2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在4555%左右。设计引物时要考虑3端和5端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54C 3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。,（一）PCR引物设计原则,.,5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异

12、性扩增。 6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。,.,7、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以这种引物参与的PCR反应产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。,.,（二）引物设计的方法,现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特

13、定网页，在线引物设计的网站有： http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/primer3www.cgiwww.cgi; /cgi-bin/SGD/web-primer; http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi; /urolab/methprimer/index1.html; /rawprimer.html,.,10扩增缓冲液 10ul 4种d

14、NTP混合物 各200umol/L 引物 10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul,标准的PCR反应体系,.,PCR反应条件的控制,PCR反应成分 1.PCR反应的缓冲液：10-50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。,.,Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓

15、度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。,2.镁离子浓度：1.5mmol/L,.,dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0-7.5，分装小管，于-20存放，过多冻融会使dNTP产生降解。 在PCR反应中，dNTPs浓度在20-200mol/L, dNTP浓

16、度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。,3.底物浓度：20-200mol/L,.,在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。,4.耐热DNA聚合酶：2.5-5 u,.,T

17、aqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80具有最高的聚合酶活性。75-80每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55时为22个核苷酸/秒；37和22时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。,.,Taq DNA聚合酶没有35外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Ven

18、t和Pfu DNA聚合酶。,.,Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3-OH端。但对4种dNTP聚合到3-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。,.,5.引物：0.1-0.5 mol/L PCR反应引物浓度为0.1-0.5mol/L,引物与模板的摩尔比至少为108：1。如此过量的引物才能确保模板DNA一旦变性就与引物退火，而不能与其自身退火。但引物浓度偏高会

19、引起错配和非特异性产物扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，降低扩增效率。但如果该比例太低，PCR效率也会降低。,.,6.模板,在一定范围内PCR产量随模板浓度的升高而显著升高，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应特异性，一般采用微克水平的基因组DNA或102105拷贝的待扩增片段作为模板,.,(二)循环参数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94 ，1min；95 ，30 s ；97 ，15 s ； 退火温度和时间：45-55 ，30s-1min 延伸温度和时间：72 ，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3-4kb,3-4min 循环次数：2

20、5-30次，视最初靶分子浓度而定,.,（三）PCR产物的积累规律,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,.,PCR产物的积累规律示意图,.,PCR实验中应注意的事项,由于PCR反应极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量样品的污染便有可能导致假阳性结果的出现.所以PCR操作过程中需要注意很多细节.,.,(一）PCR实验室的设置 样品制备区：,这个区域专门用于制备模板，要求：PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作，用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。,.,PCR操作区：,PCR仪应单独放在另一间实验室。另外，在PCR反应前应对准备和保持干净的PCR成分给予高度重视。所用的所有溶液应该没有核酸和核