引物探针设计培训资料.ppt

1、A，1，TaqMan荧光聚合酶链反应引物探针设计，A，2，实时荧光定量聚合酶链反应Taqman法，TaqMan -水解杂交探针，5端标记有报告分子(R)，如FAM、维克等探针3端标记有荧光猝灭剂(Q)是完整的，且R发出的荧光能量被Q基团吸收无荧光，R与Q分离。荧光Taq酶具有53核酸外切酶活性，可水解探针。A、3、A、3、TaqMan法的工作原理是将每个DNA分子放大，释放荧光信号，在循环过程中的任何一点都可以检测到荧光。答：4、建立TaqMan聚合酶链反应。1.引物和探针的设计：探针Tm为68，5不含g，可能淬灭荧光素。引物尽可能靠近探针，扩增片段为400 bp。底漆Tm为58-60。2.反

2、应参数确定为：94，10-20s，60，30-60s(Taq酶的最高核酸外切酶活性为60)。3.优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比；引物浓度：50-900纳米；探针浓度：50-250nm；4.其他与常规聚合酶链反应相同；a，5。一般原则；参考文献选择待检测病原体的目标基因。寻找大量的目标基因序列，用DNAstar等软件完成目标DNA或RNA的比对，确定物种内高度保守和物种间高度特异性的区域作为设计引物探针的目标序列。首先，选择探针，然后设计引物使它们尽可能靠近探针。选择的序列应该是高度特异性的，并且应该尽可能选择具有最小二级结构的扩增片段，因为二级结构将影响反应效率并阻碍酶的

3、扩增。建议先测试二级结构。如果不能避免二次结构，退火温度应相应提高。扩增长度不应超过400bp，最好在100-150bp之间。扩增片段越短，就越容易获得有效的扩增反应。短的扩增片段可以很容易地确保分析的一致性。当气相色谱含量保持在20%-80%之间时，富气相色谱区容易发生非特异性反应，这将导致荧光染料分析中扩增效率和非特异性信号的降低。为了确保效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G(不能有4个连续的G)。引物和探针应相互配对进行检测，以避免形成二聚体和发夹结构。A、6、探针设计原则，探针位置应尽可能靠近上游引物，探针长度应为15-45bp(优选20-30bp)，以保证结合特异性检测探针

4、的DNA折叠和二级结构TM值为65-70，通常比引物Tm值高5-10(至少5)，探针的气相色谱含量为40%-70%。在整个探针中，碱基C的含量明显高于G的含量此时，应选择另一对链作为探针。为了确保引物探针的特异性，最好在blast中验证设计的序列。如果存在非特异性互补区，建议重新设计引物探针。引物设计原则，序列选择应避免在基因保守区的引物或引物之间形成4对或更多的连续对，并避免形成引物的环状发夹结构。典型的引物有18到24个核苷长。引物需要足够长，以确保序列的唯一性，并减少序列存在于非靶序列位点的可能性。然而，长度大于24个核苷酸的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能与错配的序列杂交，这

5、降低了特异性，并且杂交比短序列慢，因此降低了产量。TM值为55-65(因为核酸的核酸外切酶活性在60时最高)，并且具有气相色谱含量的引物之间的Tm差异为40%-60%。避免在引物的3端使用碱基A，避免在引物的3端使用三个或更多连续的相同碱基。为了避免基因组的扩增，引物设计应该跨越两个外显子。Taqman探针技术要求在50 BP-150 BP的引物末端(最后5个核苷酸)不超过2 G和C。A，8，TaqMan方法的优点和缺点，A，9，TMA检测技术的示意图，A，10，TMA扩增反应的示意图，A，11，技术原理，在相同的温度下，首先，通过M-MLV逆转录酶产生目标核酸(RNA)的双链DNA拷贝，然后

6、通过T7 RNA聚合酶从该DNA拷贝产生多个(100 10000个)DNA拷贝。同时，带有荧光标记的探针与这些核糖核酸拷贝特异性结合，产生荧光。荧光信号可由荧光检测仪器实时捕捉，扩增周期可实时反映。A，12，分子信标探针，结构自由能控制在3和5之间，A，13，非T7引物，CTATGCATTGCTGATTGGAACTT，A，14，T7引物，Taatacactcactatagaga acctattctattctattcatccatca，A，15，TMA检测技术的优点，领先的核糖核酸检测技术TMA技术病原体细胞含有高达核糖核酸拷贝，这大大提高了检测灵敏度。先进的等温扩增技术核酸扩增在一个温度(42)

7、下进行，没有热循环。更高的检测灵敏度和准确度TMA技术具有极高的扩增效率，可在15 30分钟内使模板加倍，检测灵敏度和准确度远高于其他核酸检测技术。有效解决核酸检测的污染问题。污染是核酸检测的最大问题。TMA技术的扩增产物是RNA，在环境中自然降解，污染少，进一步提高了检测结果的可靠性。高效自动检测TMA技术采用实时荧光检测，自动化程度高，解放了操作人员，可获得标准稳定的结果。一、十六、三甲胺与实时荧光PCR相比，均采用实时荧光检测技术，三甲胺比PCR检测更灵敏；特别是加入内标后，聚合酶链反应的灵敏度大大降低。三甲胺检测扩增的最终产物为核糖核酸，而聚合酶链反应扩增的最终产物为脱氧核糖核酸；核糖核酸容易自然降解，而脱氧核糖核酸相对稳定，也就是说，在污染控制中，三甲基氨基甲烷检测更容易。TMA操作不需要复杂的热循环仪，但它可以溶解在水中；然而，聚合酶链反应检测要求TMA扩增效率高达1000拷贝/周期，而聚合酶链反应仅2拷贝/周期。在全球诊断技术发展的四个阶段中，低灵敏度导致缺陷的检测周期长，如漏检和误检，这在发展中国家由于成本低仍被广泛使用。灵敏度落后于核酸等温扩增技术的最新过渡技术。在血