第十六章 转基因技术与作物育种(二)

1、基因工程是生物技术的核心技术，是最重要、最引人注目的前沿学科之一。第十六章转基因技术与作物育种；4.受体细胞(I)定义受体细胞，又称宿主细胞，是指能够吸收外源基因并稳定维持的细胞，具有应用价值和理论研究价值。(2)物种*原核受体细胞*植物受体细胞*动物受体细胞；(3)受体细胞选择的基本原则，*促进重组DNA分子的引入和克隆的筛选。*能使重组DNA分子在细胞中稳定存在。*适用于外源基因的高效表达和表达产物的分泌或积累，并应具有良好的翻译后处理机制，用于真核靶基因的高效表达。*遗传稳定性高，遗传密码的应用没有明显的偏差。*易于扩大培养或发酵，具有较高的生产应用和理论研究价值。*安全性高，无致病性，

2、无环境污染。易于吸收外源DNA，增殖迅速，基因组简单，便于培养和基因操作，可用作受体细菌的cDNA文库和基因组文库。大肠杆菌、蓝细菌、农杆菌，(4)原核受体细胞、酵母，(5)酵母受体细胞，酵母是最简单的真核单细胞生物；它是外源真核基因最理想的表达系统。在合适的培养条件下，活的体外体细胞可以容易地再分化成植物，并且具有外源基因的体细胞可以培养成传代的植物并成为转基因植物。(6)植物受体细胞。生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞通常用作基因转移的受体细胞。体细胞可以表达基因产物，许多克隆动物都是通过体细胞培养的。体细胞不容易再次分化成个体。(7)动物受体细胞，基因工程的第三条技术路线，获取DNA片段(目

3、的基因的分离和制备)将DNA片段与载体的连接3354重组DNA外源性DNA片段导入受体细胞基因克隆和基因库筛选与鉴定克隆(包括目的基因)目的基因的表达、将重组DNA导入受体细胞受体：原核生物，真核生物原核生物：大肠杆菌真核生物：酵母导入方法：目前有许多方法，但应采用哪一种取决于所选择的载体系统和受体细胞的类型，受体细胞是指处于生理状态的细胞，可吸收外部的DNA分子。1。将重组DNA分子引入原核细胞和感受态细胞，携带靶基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达。(1)转化，使用质粒作为载体，(2)转导，通过噬菌体(病毒)颗粒感染将DNA导入感染的受体细胞的过程。在导入受

4、体细胞之前，含有靶基因和噬菌体(病毒)载体重组DNA分子的DNA必须在体外包装。共培养转化的受体细菌、含有重组DNA分子的供体细菌和含有多种宿主辅助质粒的辅助细菌。在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体细菌细胞中。(3)三亲交配，由于真核生物的细胞结构复杂，适用于原核生物的基因转移方法不能有效地用于真核生物。2.将重组脱氧核糖核酸分子引入真核细胞；(1)将重组DNA分子导入植物细胞，将钛质粒载体与含有目的基因的DNA片段重组，将其导入根癌农杆菌，然后通过叶盘转化、原生质体共培养和悬浮细胞共培养介导的根癌农杆菌将它们导入植物细胞。1)由根癌农杆菌介导的钛质粒载体的转化，植物材料的叶的表面

5、灭菌，用无菌打孔机从叶上除去圆形碎片，和接种含有钛质粒载体的重组DNA的根癌农杆菌。转基因植物可以通过从圆形小片生长的愈伤组织的筛选培养和再分化培养获得。叶盘转化，取含钛质粒载体重组DNA的致癌农杆菌，与植物原生质体和新再生细胞进行短期共培养原生质体共培养转化，这种方法类似于原生质体共培养转化，除了首先建立植物悬浮细胞系。悬浮细胞共培养转化，农杆菌介导的方法通常用于双子叶植物。将含有目标基因的外源DNA与金等金属颗粒混合，使其吸附在金属颗粒表面，然后用基因枪轰击，使其与高速金属颗粒一起进入植物细胞。在外力的作用下，金属颗粒可以进入植物细胞而不会对细胞造成致命的伤害，植物细胞仍然可以维持正常的生

6、命活动。2)轰击，基因枪法，将重组DNA应用于授粉后的柱头，或通过显微注射器将DNA注入子房，使DNA沿花粉管通道进入胚囊或通过卵子、受精卵和珍珠心脏转移组织，转化没有正常细胞壁的早期胚胎细胞，体内产生转基因种子。3)花粉管通道法，聚乙二醇、聚赖氨酸和聚鸟氨酸是常用的辅助DNA转移的聚合物，特别是聚乙二醇被广泛使用。4)聚合物介导的方法，其中聚合物与二价阳离子(Mg2，Ca2，Mn2)和DNA混合，这可以在原生质体表面形成颗粒沉淀并使DNA进入细胞。细胞膜的基本成分是磷脂。在适当施加的脉冲电场作用下，细胞膜被破坏，但达不到对细胞的致命伤害。施加的电场消除后，被刺破的孔可以自行恢复。转基因植物可

7、以通过将植物原生质体与外源DNA分子混合，将它们置于电击装置的样品室中，进行直流脉冲处理，然后进行常规的再分化培养和筛选来获得。5)电穿孔，其中在荧光显微镜下用激光处理细胞，细胞周围的重组DNA进入细胞。这种方法最适用于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。6)激光微束穿孔，使用小直径高能激光微束可导致细胞膜可逆穿孔。带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因与病毒DNA分子一起整合到受体细胞的染色体DNA中；(2)将重组DNA分子引入哺乳动物细胞，(1)转导病毒颗粒，并且有三种主要类型的转导病毒DNA或核糖核酸构建载体。带有目标基因的病毒基因组有缺陷，需要与另一种辅助病毒一起感染受

8、体细胞；带有目标基因的病毒基因组是有缺陷的，但是被感染的受体细胞的基因组已经整合了病毒缺失基因。动物细胞可以捕获附着在细胞表面的脱氧核糖核酸-磷酸钙沉淀；2)化学处理，DEAE葡聚糖、磷酸钙和二甲基亚砜促进哺乳动物细胞捕获外源性DNA分子，增加外源性DNA在细胞表面的吸附能力，增加细胞膜的通透性。由人工构建的磷脂双层组成的膜状结构包裹用于转染的DNA分子，并通过脂质体与细胞接触。3)脂质体，细胞周围的DNA随微针穿刺形成的小孔进入细胞，或随穿刺针进入细胞。显微注射法是将外源DNA分子直接注射到细胞中，4)显微注射“穿刺”，原理和操作过程类似于植物细胞的电穿孔转移，5)电穿孔，2)克隆筛选、克隆

9、和受体细胞，它们能吸收外源DNA并在其中稳定地保留分子。转化体，通过转化方法获得的克隆。重组体，真正含有重组DNA分子的转化体。ampr(抗氨苄青霉素)、cmpr(抗氯霉素)、kanr(抗卡那霉素)、Tet(抗四环素)和strr(抗链霉素)等。1.根据载体选择标记基因(目前常用的选择标记基因)筛选转化体、抗生素抗性基因和LacZ基因，(1)筛选抗生素抗性基因和相应的选择药物、抗性基因，将含有目标基因的DNA片段插入选择标记基因区域之一，导致基因插入失活。双抗选择性标记载体，epsps基因，(2)载体除草剂抗性基因和相应的选择性药物筛选，草甘膦抗性，具有完全乳糖操纵子的细菌可以翻译-半乳糖苷酶(

10、z)，通透酶(当培养基中含有5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷和IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)时，会产生蓝色沉淀，使菌落变成蓝色。(3)乳糖操纵子lacZ基因的筛选，用含有lacZ的载体转化互补菌株，在X-gal和IPTG培养基中培养，克隆为蓝色菌落，未转化互补菌株的菌落为白色。当含有目标基因的DNA片段被插入lacZ基因区域时，即使互补菌株的细胞被转化，白色菌落也将在含有X-gal和IPTG的培养基中生长。根据菌落的蓝色和白色筛选出含有目标基因的克隆。由于生长成白色菌落的互补菌株的干扰，一个基因(ampr等。)用于构建载体时组装的耐药性筛选。(5)核苷酸合成代谢相关基因的缺失互补筛

11、选，(4)生长调节剂的独立筛选，定义：一种特殊的基因，其编码产物可被快速检测，以判断外源性DNA是否已被引入受体细胞并检测其表达活性。1.未转化细胞中不存在表达产物及其功能。转化体和报告基因通过使用报告基因来筛选，报告基因必须具有两个主要特征2。通常在将含有目标基因的DNA片段与克隆载体连接之前，检测报告基因连接在目标基因的上游或下游是方便的。Gus染色棉花胚状体，常用报告基因，*gus(-葡萄糖醛酸酶)基因，gus基因产物可分解4-甲基伞形酮-葡萄糖醛酸酶产生荧光物质4-甲基伞形酮，转基因烟草萤火虫荧光素酶，* luc(荧光素酶)基因，荧光素三磷酸腺苷，荧光素腺苷酰化复合物* gfp(绿色荧

12、光蛋白)基因，绿色荧光蛋白，395nm，荧光蛋白；3.根据噬菌斑筛选，重组DNA分子(目的基因载体)必须达到野生型DNA的75%105%，才能进行体外包装。1.根据重组脱氧核糖核酸的分子大小，(1)根据重组DNA的分子特征，从克隆中提取DNA，凝胶电泳检测。(3)重组体的鉴定：从克隆中提取DNA，用合适的限制性酶消化，用凝胶电泳检测。如果片段的数量和大小与被这些酶切割的用于转化的原始外源DNA的数量和大小相同。2.限制性内切酶分析：根据目标基因两端的已知核苷酸序列，设计并合成一对引物，待鉴定克隆的总DNA作为扩增模板。如果获得了特异性扩增的DNA片段，则表明待鉴定的克隆含有靶基因。3、聚合酶链

13、反应分析，优点：灵敏、快速，可被确认为完整的靶基因，杂交方法：点杂交、噬斑杂交，4、分子杂交、脱氧核糖核酸杂交P48:当来自不同来源的两个单链脱氧核糖核酸分子的核苷酸互补时，在复性条件下可形成双链脱氧核糖核酸。和southern印迹)，DNA杂交探针P48:是指具有特定标记的特定核苷酸序列，其可以退火和杂交与核苷酸序列互补的DNA，并且可以根据标记的性质进行有效检测。杂交探针类型：32P、生物素、地高辛或荧光素，提取待鉴定转化体的总DNA，将样品直接点在分子杂交膜上，并与含有靶基因DNA互补片段的探针杂交。如果有明显的杂交信号，可以认为是一个真正的克隆。(1)点杂交法，其中菌落或斑块直接转移到

14、膜上进行分子杂交，然后进行裂解和变性处理，然后与探针杂交。(2)菌落杂交或噬斑杂交，DNA分子，限制性片段，与放射性标记的DNA探针杂交，与DNA片段的凝胶，凝胶，滤膜，(3)southern印迹，提取总DNA，用限制性内切酶切割，凝胶电泳，变性，转移到杂交膜，与探针杂交。5.利用DNA芯片进行鉴定、提取DNA或核糖核酸、荧光标记并与芯片杂交，上述方法可以得出克隆含有目的基因，但目的基因的核苷酸序列不能被理解的结论。(2)根据目的基因转录产物(mRNA)的鉴定，在一定条件下，RNA可以与转录RNA的模板DNA链杂交，目的基因DNA探针可以通过northern印迹制备，然后变性后与克隆总RNA杂

15、交。如果出现明显的杂交信号，可以确定进入受体细胞的靶基因转录了相应的信使核糖核酸。基因的最终表达产物是蛋白质(酶)，因此一些检测蛋白质的方法可以用来检测目标基因的表达产物。(3)根据目标基因翻译产物的鉴定，1 .蛋白质凝胶电泳鉴定表明，重组体含有外源基因，外源基因表达的多肽(蛋白质)被添加到其表达产物中；2.免疫分析鉴定，利用细胞中表达的蛋白质作为抗原，并使用相应的特异性抗体进行鉴定。酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫吸附试验、固-液和抗原-抗体系统，通过酶反应检测抗体和抗原的结合。基因工程技术已经广泛应用于工业、农业、畜牧业、医药、法律等领域。用生长激素转基因小鼠，第四节，基因工程的应

16、用，第三节，转基因作物的生物安全性。到目前为止，转基因作物的安全性在世界范围内引起了激烈的争论。反对者认为，转基因作物具有巨大的潜在危险，可能对人类健康和人类生活环境构成威胁。在欧洲，转基因作物被一些媒体称为“科学怪人食品”。弗兰肯斯坦是英国科幻小说中一位科学家创造的怪物，最终毁灭了这位科学家。那么，人类是通过发展和种植转基因作物来毁灭自己还是拯救自己呢？在关于转基因作物安全性的国际辩论中，有几个典型事件。普斯泰事件：1998年秋天，英国罗维特研究所的普斯泰博士用含有雪花莲凝集素基因的土豆喂养老鼠，并在英国电视上发表讲话，声称老鼠吃了这种土豆后体重和器官重量减轻，免疫系统受损。后果：绿色和平组

17、织、地球之友和其他反生物技术组织称这种马铃薯为“杀手”，并计划采取行动，如摧毁转基因作物的实验场地，烧毁印度的两个实验场，甚至摧毁美国加州大学戴维斯分校的非转基因实验材料，从而使研究生的毕业论文无法如期完成。皇家学会组织了一次同行评议，并于1999年5月发表了一份评论，指出普斯泰的实验有六个错误：不能确定转基因马铃薯和非转基因马铃薯的化学成分是否存在差异；对于吃转基因土豆的老鼠，没有添加蛋白质来防止饥饿；受试动物的数量很少，并且它们被喂食几种不同的食物，这些食物不是大鼠的标准食物，并且缺乏统计显著性。统计方法不当；测试结果不一致。1999年5月，康奈尔大学的一个研究小组在Nature杂志上发表了一篇文章，声称转基因抗虫玉米的花粉漂浮在一种叫做“马利筋”的杂草上，马利筋的叶子被喂给美国蝴蝶，导致其44%的幼虫死亡。实验结果在科学上并不令人信服：玉米的花粉很重，传播不远，在距玉米田5米的