单向扩散试验

1、,第六章 沉淀反应,第一节 沉淀反应原理及特点,沉淀反应（precipitation）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。,与经典的抗原抗体 反应相同,原理,特点,抗原抗体特异性结合，快速但不可见。免疫比浊法中的速率法就是利用此阶段测定免疫复合物形成的速率,形成肉眼可见的大的免疫复合物。沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物,第一阶段,第二阶段,沉淀反应分两个阶段,免疫浊度测定 絮状沉淀试验,单向扩散试验 双向扩散试验,对流免疫电泳 火箭免疫电泳 免疫电泳 免疫固定电泳,沉淀反应可分为三大类型,液体内沉淀试验,凝胶内沉淀试验,凝胶

2、免疫电泳技术,第二节 液体内沉淀试验,絮状沉淀试验 （flocculation）,絮状沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。 方法受抗原抗体比例的影响非常明显 应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型),絮状沉淀试验,抗原稀释法：抗原最适比例,抗体稀释法：抗体最适比例,方阵滴定法：抗原抗体最适比例,表 最适比方阵测定法,当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。,免疫浊度测定 （immunoturbidim

3、etry）,原 理,1.抗原抗体的比例：反应体系中保持抗体过量 2.抗体的质量 ：特异性强，效价高，亲和力 强并使用R型抗体 3. 抗原抗体反应液的最适PH为6.58.5 4.使用增浊剂,免疫浊度测定,影响因素,第三节 凝胶内沉淀试验 gel phase precipitation,原 理,可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。,单向扩散试验 （平板法） single diffusion test,原理：抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。 环的大小

4、与抗原的浓度成正相关。,技术要点：将抗体混入0.9%琼 脂糖内（50 ），未凝固前倾 注成平板，凝固后打孔（直径 35mm ），孔中加入抗原溶 液和不同浓度的标准品，置湿 盒内37,2448h 观察孔周 围是否出现沉淀环。,定量试验,单向扩散试验（平板法）,倾注平板 打孔 加样 放置37 2448h观察沉淀环,单向扩散试验 （平板法）,沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法,Mancini曲线： 大分子抗原（IgM） 时间扩散48h， 常数KCd2 普通坐标纸曲线,Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA） 扩散时间24h 常数KlogCd 半对数坐标纸曲线,C为抗原浓度， d为沉淀环直径

5、,T1为1624h；T2为2448h；T3为48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物线,t1为1624h；t2为2448h；t3为48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线,Mancini曲线,Fahey曲线,影响因素： 抗体质量 标准曲线 ，质控血清 结果与真实含量不符 单克隆抗体；多克隆抗体；可出现假性降低与增高 双环现象 不同扩散率抗原性相同的两个组分,单向扩散试验 （平板法）,单向扩散试验 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清，下排右2为异常病理血清,双向扩散试验 （平板法） double diffusion test,原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖不同的对应孔中，两者在凝胶中

6、自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。,技术要点：平板玻璃上倾注一层均匀的琼脂糖薄层，凝固后打孔，孔径为3mm，孔间距在35 mm之间，在相对的孔中加入抗原或抗体，放置湿盒371824h 后，观察孔周围是否出现沉淀环。,鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一,双向扩散试验 （平板法）,应用,1.抗原或抗体的存在与 否以及相对含量的估计,2.抗原或抗体相对分子 量的估计,双向扩散试验 （平板法）,应用,3.抗原性质的分析,双向扩散试验 （平板法）,应用,4.抗体效价的滴定,5.抗原或抗体纯度 的鉴定,第四节 免疫电泳技术 immunoelectrophoresis technique,免疫电泳技

7、术,优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。,电泳分析,沉淀反应,抗原抗体反应 的高度特异性,电泳技术的高 分辨率、快速、 微量,对流免疫电泳 counter immunolectrophoresis,CIEP,原理：双向扩散 + 电泳 比双向扩散试验灵敏度提高816倍,技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件34mA/cm，30min1h。,对流免疫电泳,通电,蛋白质抗原常带较强的负电荷，在电场中向正极移动,抗体球蛋白 带负电荷较少，籍电渗作用向负极泳动,结果分析

8、： 无沉淀线出现则表明无相应的抗原。 沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比例较适合。 沉淀线偏向抗原孔一方，表示抗体浓度抗原，反之，则是抗体浓度抗原浓度。,对流免疫电泳,火箭免疫电泳 racket immunoelectrophoresis,RIE,电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关,原理,单向免疫扩散电泳,定量检测技术,火箭免疫电泳,1.2%巴比妥琼脂糖约55，加入适量抗血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，

9、样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。,技术要点,1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲酰化），抵消了电渗作用。,火箭免疫电泳,影响因素,火箭免疫电泳示意图,免疫电泳 immunoelectrophoresis IEP,原理：区带电泳双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。,技术要点：制备琼脂板 打孔，加样于孔内，电泳23mA/cm ，0.51h后，槽内加入相应抗血清作双向扩散,

10、免疫电泳,纯化抗原和抗体成分的分析及正常和 异常免疫球蛋白的识别与鉴定,影响因素,抗原抗体比例不当,需测抗原抗体最适比,抗血清的的抗体谱 ，混合抗血清的使用,电泳条件直接影响分辨率,应 用,免疫电泳示意图,免疫固定电泳 immunofixationelectrophoresis,IFE,免疫电泳原理，不同之 处是将抗血清直接加于电泳 后的蛋白质区带表面，抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物 ，经染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型,原理,区带电泳沉淀反应,免疫固定电泳,先将患者血清或血浆在醋纤膜或琼脂上作区带电泳，根据血清蛋白质的电荷不同将其分开，然后将IgG、IgA、IgM、轻链和轻链的抗血清加于分离的蛋白质泳道，参考泳道则加蛋白质固定剂，用于区带对照，作用一定时间后