核糖体展示技术

1、核糖体展示技术,基因控制生物性状,基因指导蛋白质合成的过程，叫基因的表达。,问题：基因是怎样指导蛋白质的合成呢？,细胞质,细胞核,核孔,DNA,mRNA在细胞核中合成,？,甲硫氨酸,核糖体,tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置,两个氨基酸分子缩合,缩合,亮氨酸,核糖体随着 mRNA滑动. 另一个 tRNA 上的碱基与mRNA上的 密码子配对.,亮氨酸,一个个氨基酸分子缩合成链状结构,亮氨酸,天门冬酰氨,tRNA离开，再去转运新的氨基酸,亮氨酸,天门冬酰氨,异亮氨酸,以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质,1、核糖体展示技术原理,核糖体展示技术是一种筛选蛋白质强有力的工具, 通过将

2、基因型和蛋白表型联系在一起,利用目标蛋白 的特异性配基从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白 和相应基因序列。 原理：对体外进行转录与翻译,编码蛋白的DNA进 行特殊的加工与修饰,如:去掉3末端终止密码子或 者利用了嘌呤霉素将mRNA与多肽以共价键的形式 联系起来,使得核糖体-mRNA-蛋白质三元复合物稳,定。然后利用ELISA微孔或磁珠筛选出含有目标蛋 白的核糖体三聚体，对筛选得到的复合物进行分解, 释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应(RT- PCR ),PCR产物进入下一轮循环,经过多次循环,最终使目 标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离(见 图1)。 .,体外核糖体展示肽库构建与筛选原理

3、示意图,2具体方法,1）基因片段的改造 为了使基因片段能有效转录和翻译,5端应接 上T7启动子序列和SD序列，去掉3端的终止密 码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3末端, 将蛋白质和mRNA连接在一起。在对基因片段改 造时,常进行多次延伸PCR： 分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来, 用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因 和间隔子连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含 有3端茎环结构序列。 PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动 子序列和5端茎环结构序列,下游产物同前。最 后得到的PCR产物,5端接上T7启动子和茎环结 构以及SD序列,3端则融合了间隔序列并含

4、有 3端的茎环结构(见图2),2）体外转录和翻译,体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞 蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液 和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统 更适合,目前尚有争议.体外转录与体外翻译可以 偶联进行,也可以分别进行.目前,已有以DNA 为 模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外 转录与翻译偶联的商用系统问世。,对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质,转录和 翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在 氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合 酶要求具还原性的-巯基乙醇维持其稳定性。 如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体 外转录

5、/翻译偶联体系效果可能更好.,若分别进行,则需要控制RNase的影响.VRC 过渡态类似物作为RNase抑制剂,能有效抑制 核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后 立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行 降低RNase的影响。另外,3端和5端的茎环 结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNase和 核酸内切酶RNase E的影响。,3）亲和筛选,体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实验，也可以于4保存，核糖体复合物在4至少可以稳定10 d，但产量会逐渐减少。体外

6、筛选时加入1%2%脱脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝素还能抑制核酸酶。,亲和筛选 分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和 磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中，抗原包被 在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会 影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗 体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗 原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗 原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标 签,进行亲和筛选。,mRNA的分离,筛选完后，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓 冲液洗脱mRNA。洗脱下来的mRNA用DNase 处理去除残留的DNA模板，进行RT-

7、PCR反应重 新引入T7启动子，SD序列等核糖体展示必需元 件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评 价筛选效率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质 粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标 克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体 型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。,4）体外分子定向进化,用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时, 可以通过易错PCR或(DNA shuffering)等方法引 入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获 得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子 的机率.Plckthumx小组利用核糖体展示技术筛 选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入 DNA重排技术,又将其亲和力提高了30倍。,3 核糖体展示技术的优势、问题、展望,a 优势: 核糖体展示技术完全在体外进行,与噬菌 体或酵母菌展示技术相比具有建库简单、库容量 大、分子多样性强、筛选方法简便、无需选择压力, 还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲 和力等优点,是一种筛选大型文库和获取分子进化强 有力的方法。 b 存在的问题:如何进一步地提高该系统的稳定性；,特别是如何防止mRNA的降解和形成稳固的蛋白质- 核糖体-mRNA三聚体无疑是该技术的关键问题；如 何提高大分子蛋白