Seahorse海马代谢仪使用说明.ppt

1、a,1,Seahorse,汇报人： 学号：,a,2,背景,生物能量学（Bioenergetic） 探讨的是生物将氧份转为能量并借此推动生命的过程。不同的细胞依据其生理特性及健康状况，能量供需系统亦有所不同。,a,3,简介,美国海马生物科学利用细胞外流量（Extracellular Flux，XF）检测专利技术，发明了业界第一款海马细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪（Seahorse XF Extracellular Flux Analyzers），是进行细胞代谢分析、氧呼吸测定、药物代谢分析、线粒体有氧代谢和糖酵解等功能的最佳分析工具。 特点：通过特殊的细胞培养微孔板设计，在测量时临时

2、形成的约2ul微环境中，利用无创的专利光学传感器同步地实时探测溶解氧（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）变化，从而快速了解细胞内两大能量转换途径（线粒体的有氧代谢和糖酵解）的能量代谢状态。,a,4,a,5,仪器外观,a,6,Hydro Booster,Sensor Cartridge,Cartridge Lid,耗材,a,7,a,8,自动药物注射端口 启用实时功能分析,a,9,Cell Mito Stress Test Assay Kits,a,10,水化探针,1.在Utility Plate每孔中加入1ml校准液 (Seahorse XF 校准液用于溶解和校准 XF 小柱，并包含 FluxP

3、ak),实验前一天,a,11,2.将Hydro Booster放在Utility Plate上，Sensor Cartridge放在最上面,a,12,3.放入无CO2的培养箱，37过夜（使校准液能浸没在sensors中；保证培养箱湿度，防止干燥）,a,13,培养细胞,1.100ul培养液收集细胞，按最佳细胞密度重悬细胞（10,000 - 80,000个细胞/孔）。 2.每孔接种100 L细胞悬液，背景校正孔（A1, B4, C3, D6）不接种细胞。将细胞板室温静置在超净台上1 h。 3.将细胞板放置在细胞培养箱中让细胞贴壁（快1h；慢5-6h），在显微镜下观察细胞是否贴壁。 4.细胞贴壁后，

4、每孔加入150 L生长培养液，总体积为250 L。加液时，沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。 5.将细胞放置在细胞培养箱中过夜培养。在显微镜下观察细胞的生长状态。,a,14,预热仪器,打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37 ，过夜预热。,a,15,准备XF检测液,一个培养板 手动加液需100ml，仪器加液需200ml 1.使用NaOH调节pH值至7.350.05 2.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。 3.37放置备用。,NO sodium bicarbonate Low phenol red (3 mg/L),实验当天,

5、a,16,处理细胞,1.将细胞培养板从CO2培养箱中取出，并记录时间。 2.在显微镜下观察细胞（无污染，细胞均匀状态好，贴壁未脱落，背景矫正孔无细胞。） 3.用XF细胞线粒体压力测试检测液洗细胞： a.吸去生长培养液至每孔剩余50 L。 b.用1 mL XF检测液洗细胞两次。 c.每孔加入检测液至终体积为500 L/孔。 4.在显微镜下观察细胞，确认细胞在换液过程中没有脱落。 5.将细胞板置于37C无CO2培养箱中1 h。,a,17,配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物母液,a,18,a,19,将药物稀释为10浓度，用于加到加药孔中,3.取300 L 50 M rotenone/antimyci

6、n A母液至2700 L检测液中。,2.按以下表格，用检测液将FCCP稀释为不同的浓度,1.按左边表格，用3 mL 检测液将oligomycin稀释为所需浓度（或使用大多数细胞都适用的1 M）。,a,20,加药,从无CO2培养箱中取出已水化的测试板。按以下说明，将药物分别加到每个加药孔里。 加药孔A：细胞孔内oligomycin终浓度为1 M。每个A孔加入56 L 10药物。 加药孔B：测定浓度的FCCP。将62 L 10的不同浓度药物加入到B孔里。 加药孔C：细胞孔内Rot/AA终浓度为0.5 M。每个C孔加入69 L 10药物。,a,21,a,22,选择模板（提前预热）,a,23,Inje

7、ction strategies-add-strategy 1-A-add-mito stress test1,B C同样,a,24,Pretreatment-add-不用做修改,a,25,Assay Media-Mito Stress test medium,a,26,填写相关信息：Name ,Cell Type, Seeding density（Cell Type2，3， 4 同样），之后点击“Generate Group”查看,a,27,“Plate Map”设置颜色,a,28,默认的 Mix-Wait-Measure时间为3 min-2 min-3 min。通常在加药前测量3次基础值；

8、每次加药后再进行3次测量。 “Injection”多少种药点多少次,a,29,Review Run-Plate Information-Well Volume-Plate by-Start Run，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板换为细胞培养板。点击Continue。仪器完成OCR值测定，数据分析。,a,30,寡霉素：ATP合酶抑制剂； FCCP：解偶联剂 ； 抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；,a,31,a,32,a,33,a,34,How do I know whether the cell density is good?, Basal OCR range: 20-160 pmol/min Maximum recommended OCR: 400 pmol/min ECAR: 5-100 mpH/min,a,35,a,36,优势特点：,采用超敏感的生物传感器和非接触式设计，真正实现检测细胞零损伤； 实时检测细