生物化学 第11章柠檬酸循环

1、第十一章柠檬酸循环。柠檬酸(TCA)流通过程中的关键化合物是柠檬酸。因为柠檬酸有三个羧基，所以也被称为三羧酸循环(TCA)。柠檬酸循环发生在细胞的线粒体中。柠檬酸循环不仅是糖的有氧代谢途径，也是脂肪酸和氨基酸的代谢途径。柠檬酸循环的中间体也是许多物质生物合成的前体。在无氧条件下，葡萄糖经过糖酵解获得能量，产生的丙酮酸被还原成乳酸(或乙醇):c6h 12o 62 h3c-choh-COO-2hgo=-196 kj/mol。然而，在氧的存在下，葡萄糖被完全氧化成CO2和H2O。并产生细胞活动所需的大量能量：c 6h 12 o 6 o 26co 26 H2Ogo=-2867 kj/mol，表明糖的厌

2、氧分解产物中有丰富的能量，而乳酸分子也含有葡萄糖分子可用能量的93%。在氧气的条件下，它最终被氧化成CO2和H2O。这种代谢过程称为呼吸或细胞呼吸。因为这个过程消耗氧气并释放二氧化碳。细胞呼吸可以分为三个不同的阶段。第一阶段是葡萄糖通过糖酵解转化成丙酮酸，丙酮酸被氧化成乙酰辅酶a；对于细胞呼吸的其他有机燃料分子、脂肪酸和氨基酸，它们也可以通过相应的代谢途径转化为乙酰辅酶a。在第二阶段，由有机燃料分子氧化产生的乙酰辅酶a进入被称为柠檬酸循环的代谢途径，并被酶促转化为CO2，同时产生还原电子载体NADH和FADH2。在第三阶段，前两个阶段产生的还原型NADH和FADH2被氧化，再次形成氧化辅酶。第

3、1节丙酮的氧化在有氧条件下，通过糖酵解或乳酸氧化产生的丙酮酸或通过某些氨基酸分解产生的丙酮酸通过特殊的载体蛋白转运到线粒体中，并首先通过氧化脱羧作用转化为乙酰辅酶a。丙酮酸氧化脱羧成乙酰辅酶a是由丙酮酸脱氢酶复合物催化的。该酶复合物由丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫代辛酰基转乙酰酶(E2)和二氢硫代辛酰基脱氢酶(E3)组成，它们在复合物中各有多个拷贝。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物的分子量约为4600kD，其球形直径约为30纳米。该建筑群的核心由24个E2组成，24个E1和12个E3围绕E2布置。真核生物中的丙酮酸脱氢酶复合物比大肠杆菌中的酶更复杂。双丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应催化五个连续的反应。总

4、反应为三氯甲烷-一氧化碳-一氧化碳-硫氰酸盐三氯甲烷-一氧化碳-一氧化碳-二氧化碳。丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应涉及五种不同的辅酶，即硫胺素焦磷酸(TPP)、硫辛酸和辅酶a。丙酮酸脱氢酶E2:二硫代转乙酰酶E3:二氢硫辛酸转乙酰酶，丙酮酸脱氢酶是一个多酶系统，位于线粒体膜上。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶系统的分子量为4.5106，直径为45纳米，略大于核糖体。辅酶亚基丙酮酸脱氢酶(E1) TPP 24二氢硫辛酰转乙酰酶(E2)硫辛酸24二氢硫辛酰脱氢酶(E3) FAD 12。此外，还需要辅酶A(CoA)、NAD和Mg2作为辅因子，辅酶a是一种重要的酰基载体。E1脱羧丙酮酸生成羟基乙酰-磷酸二氢钾，E2

5、从磷酸二氢钾接收含负碳离子的羟基乙酸生成乙酰磷酸，E3辅助FAD从二氢硫辛酸接收氢，然后将其转移到NAD生成NADH。在第二部分，柠檬酸循环是乙酰碳单元进一步氧化降解产生CO2和还原型辅酶的代谢途径。由于反应顺序是从乙酰辅酶a和草酰乙酸缩合成柠檬酸开始，草酰乙酸经过多步反应后再生，构成一个循环反应途径，因此，这种循环反应称为柠檬酸循环。1.柠檬酸循环的研究历史是物质代谢的中心，这一途径的发现在生物化学发展史上占有重要地位。德国科学家汉斯克雷布斯在阐明柠檬酸循环方面做出了特殊贡献，并于1953年获得诺贝尔医学奖。柠檬酸循环概述由丙酮酸形成的乙酰辅酶a或由其他代谢途径(如脂肪酸或氨基酸的分解代谢)

6、产生的乙酰辅酶a可被柠檬酸循环氧化，这涉及八个酶促反应。(1)柠檬酸生成柠檬酸合成酶催化乙酰辅酶a和草酰乙酸缩合生成柠檬酸，这是柠檬酸循环的初始反应。同位素标记实验表明乙酰基上的甲基碳与草酰乙酸的羰基碳结合。柠檬酸合成酶催化的反应遵循有序反应机理。因为乙酰辅酶a是一种高能化合物，当硫酯键水解时，它能释放大量能量(Go=-32.5 kJ/mol)，所以它能推动细胞中柠檬酸生成的方向反应。柠檬酸合成酶催化的反应是不可逆的，受多种效应物调节。柠檬酸合成酶反应的机理，(2)异柠檬酸盐的形成。在乌头酸酶的催化下，柠檬酸异构化成异柠檬酸盐。顺乌头酸是这一转化反应的中间体。该步骤中的反应是可逆的， GO=

7、6.3 kJ/mol，这对柠檬酸是有利的。因此，在平衡状态下，异柠檬酸仅占约10%。顺乌头酸酶顺乌头酸酶，柠檬酸是一种前手性分子，但顺乌头酸酶对柠檬酸两端的两个相同基团(-CH2-COO-)具有选择性。如反应式所示，脱水和水加成反应仅涉及柠檬酸的下半部分(即草酰乙酸的碳原子基团)。对这一选择的解释是，根据酶作用的立体专一性，酶分子的活性中心是不对称的，有三个不同的结合位点，只有当这三个不同的结合位点与底物分子的三个不同取代基互补配对时，酶才能催化。柠檬酸的中心碳与四个取代基相连，其中两个是相同的(-CH2-COO-)。但是这两个完全相同的群体在空间取向上是不同的，也就是说，它们在空间上是可以区

8、分的。顺式乌头酸酶的这一作用特征解释了为什么随后的脱羧反应只发生在与乙酰基结合位点相反的碳位点，而不是乙酰基结合位点的末端。当柠檬酸与顺乌头酸酶的活性中心结合时，酶活性中心的微环境可以区分两个具有不同空间取向的相同基团，使得两个相同基团中只有一个受酶作用，而另一个不受酶催化。异柠檬酸异柠檬酸脱氢酶的氧化脱羧催化异柠檬酸氧化脱羧为-酮戊二酸。这是柠檬酸循环中的第一个脱羧反应。在这个反应中，NADH随着nad的减少而产生。请注意，这里去除的CO2来自原始的草酰乙酸部分，而不是乙酰辅酶a的乙酰部分。在该酶的催化反应中，异柠檬酸的仲醇羟基被氧化并转化为草酰琥珀酸酯，然后-羧基发生脱羧反应形成-酮戊二酸

9、酯。Mn2+在反应中起极化新形成的羰基的作用。该反应的Go为-20.9 kJ/mol，能有效促进顺乌头酸酶催化异柠檬酸的生成。草酸是异柠檬酸脱氢酶催化反应的中间体，只能瞬间存在。然而，如果酶活性位点的残基(Tyr160和Lys230)突变，酶的活性将降低(即，将产生动力学瓶颈)，导致反应中间体的积累并证实其存在。依赖于NADP+的异柠檬酸脱氢酶也存在于哺乳动物组织中。异柠檬酸脱氢酶的反应机理。Mn2极化草酰琥珀酸中间体中的羰基。(4)-酮戊二酸在-酮戊二酸脱氢酶复合物的催化下发生氧化脱羧反应生成琥珀酰辅酶a，同时释放CO2和NADH。这里，释放的CO2也来自最初的草酰乙酸部分，而不是乙酰辅酶a

10、的乙酰基。如果顺乌头酸酶对两个相同的柠檬酸组没有选择性，那么由-酮戊二酸脱羧作用释放的一半CO2应该含有放射性标记，但实际结果不是这样。这证实了顺乌头酸酶的选择性。-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应在化学上类似于丙酮酸脱氢酶复合物。这种酶复合物也由三种酶组成：-酮戊二酸脱氢酶(E1)，二氢硫辛酰反式琥珀酰酶(E2)和二氢硫辛酰脱氢酶(E3)。E1和E2作用于不同的底物，这里E3与丙酮酸脱氢酶复合物的E3相同。-酮戊二酸脱氢酶复合物催化高能反应( GO=-33 kJ/mol)，反应产生的琥珀酰辅酶a，像乙酰辅酶a一样，含有高能硫酯键。(5)琥珀酰辅酶a合成酶，其将琥珀酰辅酶a氧化成琥珀酸，催化琥珀

11、酰辅酶a的裂解产生琥珀酸，伴随高能磷酸化合物(GTP或三磷酸腺苷)的形成。该反应的Go约为-2.1千焦/摩尔。这是柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸化合物的反应，也是底物水平磷酸化的另一个例子。因为它的逆反应可以形成硫酯键，这种酶也被称为琥珀酸脱氢酶。在哺乳动物中，GTP；通常是通过这个反应合成的；植物和细菌中的琥珀酰辅酶a合成酶通常合成三磷酸腺苷。在核苷二磷酸激酶的催化下，哺乳动物体内产生的GTP能将其末端磷酸基团转移到腺苷二磷酸上生成三磷酸腺苷：GTP腺苷国内生产总值三磷酸腺苷。琥珀酰辅酶a合酶催化的反应包括用磷酸基团取代辅酶a，并在酶的活性位点形成琥珀酰磷酸。然后，磷酸基团转移到酶活性位点

12、的组氨酸残基上，形成磷酸组氨酸并释放琥珀酸；然后磷酸盐集团被转移到国内生产总值形成GTP。(6)琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸氧化为富马酸。作为酶的辅助基团，FAD与酶的组氨酸残基共价结合，并在酶促反应过程中接收从底物中除去的电子和氢。该反应的自由能变化接近6 kJ/mol。琥珀酸脱氢酶是柠檬酸循环中唯一的线粒体内膜结合蛋白，也是琥珀酸-辅酶q氧化还原酶的一部分。琥珀酸的氧化包括从其两个碳原子的相对侧除去一个氢原子。这种涉及烷氧基化成烯烃的反应没有足够的能量来还原NAD+，但是它可以将FAD还原成FADH2。相反，醇或酮的氧化反应可以产生足够的能量来促进NAD+的还原。琥珀酸脱氢酶是由分子量为70kD

13、和27kD的两个亚基组成的二聚体蛋白。FAD共价结合到大亚单位上。琥珀酸脱氢酶也含有铁硫簇。这种酶催化的反应是立体专一的。它只能催化琥珀酸从与富马酸(富马酸)相反的位置脱氢或其逆反应，但不能催化琥珀酸从同侧脱氢为马来酸或其逆反应。因为琥珀酸脱氢酶没有能力区分琥珀酸的相同两端，如果在柠檬酸合成中使用的乙酰基羰基碳预先用14C标记，由上述六个步骤产生的琥珀酸的羧基碳应该包含放射性标记，除了每个羧基碳的放射性强度仅保持原始标记的50%，然后每个化合物的羧基碳也是如此。(7)富马酸的水合反应富马酸的双键在富马酸酶的催化下被水合生成L-苹果酸。因此，富马酸酶也被称为富马酸水合酶。水合反应很可能首先形成负

14、碳离子的转化形式。在过渡态的形成中，它被羟基阴离子攻击形成负碳离子，接着发生质子(氢)反应。反应 go=-3.4kj/mol。富马酸酶具有高度的立体专一性。它只作用于富马酸，从双键的相反方向加入羟基和氢生成L-苹果酸，或催化其逆向反应，L-苹果酸脱水成富马酸。该酶不能通过加水将马来酸催化成苹果酸，也不能催化D-苹果酸的脱水反应。(8)草酰乙酸的形成苹果酸氧化成草酰乙酸是柠檬酸循环的最后一步。催化这一反应的酶是左旋苹果酸脱氢酶。反应 GO=29.7 kJ/mol，在热力学上不利于草酰乙酸的形成，但有利于逆反应。因此，细胞中草酰乙酸的浓度非常低。然而，在细胞中，不利于草酰乙酸生产的反应可由柠檬酸循

15、环的第一反应(由柠檬酸合酶催化)驱动，并有利于草酰乙酸的生产。因为柠檬酸合成酶催化的乙酰辅酶a和草酰乙酸的缩合反应是高能的( GO=-31.5 kJ/mol)。苹果酸脱氢酶催化氢离子转移到NAD+的机制类似于乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶。x射线分析显示，这三种酶的NAD结合结构域非常相似，这与NAD结合结构域是从同一祖先进化而来的观点一致。苹果酸脱氢为草酰乙酸，III。TCA循环概述(1)当一个乙酰辅酶a分子与草酰乙酸酯缩合并进入TCA循环时，整个化学反应的最终结果是：ch3co-scoa22o 3 nad fadad PPI2co 3 nad 3h fad H2 ATP cosh，这表明在TCA循环中只有一个乙酰辅酶a分子被氧化一次，并且所有TCA中间体不会因参与反应而增加或减少。(2)乙酰辅酶a进入TCA循环后，有两次脱羧反应；在四个地方发生氧化脱氢反应，产生三个NADH分子和一个FADH2分子；底物水平磷酸化产生一个三磷酸腺苷分子。由氧化反应产生的NADH和FADH2进入电子转移链，经历氧化磷酸化，产生ATP，并再生NAD和FAD，从而重新参与TCA循环反应，维持循环的正常运行。因此，TCA循环和