感染性疾病的分子诊断

1、第八、九章感染性疾病的分子诊断，1，感染的感慨，感染是病原体与人体之间的相互作用过程病原微生物：病原菌(条件病原菌)、微生物、人体、微生物、人体，在不同的感染状态、共生状态、正常情况下，人体的一部分空洞和体表寄生着微生物，2，感染性疾病：根据某种病原体，以不同的方式寄生在人体上病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体、寄生虫。 3、常规检查方法：免疫学方法的微生物学方法受到敏感性、特异性限制，难以早期诊断，难以提供病原体分类和耐药性的信息。 4、感染性疾病的分子诊断策略、一般策略(病原体检测):判断有无感染的病原体感染的常用方法： PCR杂交完整性策略：病原体分类(分类)检

2、测亚型耐药性的常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA序列确定、5、 感染性疾病分子诊断标记物、病原体核酸分子(DNA/RNA )基因表达产物代谢物免疫应答分子，6，2，感染性疾病分子诊断的常用方法可根据目的基因是否扩增分为杂交法和扩增法。 信号放大技术的测定方法虽然目标分子的数量不变，但测定的探针信号放大采用酶、探针或者两者结合等方法，增加探针标记的浓度来放大测定信号。 目标分子扩增技术的测定方法目标分子(RNA、DNA或探针)的扩增PCR、替代扩增、LCR等，7， 图8-3NASBA的原理图，引物A5端有T7RNA聚合酶结合部位，3端的碱基和目标RNA的3端的序列互补的引物b的碱基序列与c

3、DNA3的末端序列互补，8，nucleicacidsequence-based am 整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，保真度高，其扩增效率比PCR高，特异性好。 10、图8-3NASBA的原理图，引物A5侧有T7RNA聚合酶结合部位，3末端碱基和目标RNA的3末端序列互补的引物b的碱基序列与cDNA3的末端序列互补，11，nucleicacidsequence-base 整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，保真度高，其扩增效率比PCR高，特异性好。 13、三、感染性疾病的分子诊断标本处理、标本采集处理主要选择合适的标本种类、标本量、抗凝固剂等，对标本进行适当的移送、保存和预处理。 14

4、、4、感染性疾病的分子诊断结果显示，1 .阴性结果假阴性可能性方法灵敏度过低的方法，目标分子2 .阳性结果假阳性可能性方法的特异性被污染，15、3 .定性检测结果可能不能提供病原体活力的相关信息临床治疗症状缓解后，在一定时间内，患者样品可以检测出相应的病原体。 部分病原体潜伏在体内，没有临床症状。 4 .在疾病状况的判断中检测出病原体的存在，不能说是这个病原体引起疾病的直接原因。 该病原体可能是正常菌群，用于16，5，感染性疾病分子诊断的临床应用和评价，感染性疾病治疗的监测和预测，病情发展过程的危险性评价和疾病预后等。 耐药性检查细菌的分型传染病调查，17，第一节病毒的基因检查，人的多种传染病

5、是由病毒引起的，病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等，约占人的传染病的75%。 400多种病毒。 病毒结构：大小： 20-300nm的核心区：核酸(DNA或RNA )的外周涂层：蛋白质被膜：脂质(嵌入蛋白质)，18，我国是HBV的流行地区，50p%的人感染，8%是HBV载体，肝炎患者的外壳(HBsAg):外壳蛋白质成分是表面抗原核(HBcAg):DNA聚合酶hbcag，一，乙型肝炎病毒，19， Dane粒子(完全病毒)形态，完全b型肝炎病毒粒径42nm由双重外壳和一个核心构成，核心径27nm，包含DNA双链和DNA聚合酶，20、 病毒基因组结构3.2kb双链DNA病毒不完全双链DNA长链l为负链：有

6、4个开放阅读框s、c、p、XS区编码外膜蛋白(HBsAg)C区编码HBeAg、HBcAgp区编码DNA聚合酶x区编码x蛋白短链s是正链：长短不同，21，pre-s1，pre-s2，s，p，c，pre-c，x，HBVDNA3.2kb，pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白shbsagpre-chbeagchbgpdna HBV基因分类HBV基因序列的差异多少可以将HBV分为不同的基因型，迄今为止发现了a、b、c、d、e、f、g、h共8种基因型： a型主要存在白人，b型和c型主要存在亚洲人，e型主要存在西非我国流行的主要是b和c基因型，长江以北以c型为主，长江以南以b型为主，并与

7、少量的a型、d型混合型。 西北和西南，特别是西北高比例的d型，23，A(n )，mRNA，cccDNA，HBsAg被膜，负链DNA，包着的前基因mRNA，传染性HBV病毒粒子，传染性HBV病毒粒子，部分双链DNA，逆转录酶，DNA 1.PCR一般采用PCR、FQ-PCR、竞争PCR、免疫杂交PCR，可直接提供准确的病原学诊断证据。 引物基于s、c、p、x基因的高级保守序列设计，决定扩增的特异性和灵敏度。25、扩增位置引物序列扩增片段(bp)P， x基因5-atactgcggaactcctagc-32785-ccgcgtaagagagagagagagaggggcg-3 c基因5-ataccaca

8、cagagactcggtgggact-34775-aagccctacgaccaccactgaaatgaaatggg TG acccctataa-325585-atgggattggggggtctcaa 原理：捕获探针在目标探针1系的目标探针2bDNA分子：DNA主链上结合了多个侧链、 捕获探针固化在微板上的目标探针1与捕获探针和测定对象核酸的杂交目标探针2分别与测定对象核酸和bDNA杂交形成复合体，固相支撑体，捕获探针，目标探针1CEs，测定对象核酸，目标探针bDNA复合物、29、支链DNA信号扩增技术(bDNA )、30、信号检测： bDNA可以结合多种酶标记探针，酶催化基质(1，2 -二恶二

9、酮，dioxetane )发光，放大核酸信号，发光强度与DNA量成比例。 优点：放大倍率阳性检测率高稳定性和再现性简单，省时间容易普及，31，3 .基因芯片技术标本在PCR放大后与芯片上特异的探针杂交，能检测出病毒感染病毒的种类和亚型病毒的抗性情况特征：可以同时检测出大量标本干扰素治疗HBV的压力主要集中在前C/C区和前s区。 HBV抗性突变、lamivudine、adefovir、entecavir、telbivudine、33、YMDD (酪氨酸蛋氨酸天冬氨酸天冬氨酸)、HBV的拉米夫定抗性是由HBVDNA聚合酶突变引起的。 抗性基因位点(YMDD )位于聚合酶的c区(rtM2041或rt

10、M204V )，分别由异亮氨酸(I )或缬氨酸(v )替换YMDD中的蛋氨酸(m )，形成YIDD或YVDD变异。拉米夫定和HBV逆转录酶的亲和力与位于552位的氨基酸侧链长有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，缩短侧链氨基酸长，增大逆转录酶dNTP结合区，不适合拉米夫定结合，诱发耐药性。 34，HBV抗性检测(YMDD突变检测方法)，35，YMDD突变检测方法，1 .基因测序法2 .确定了荧光定量PCR方法的基本原理，用突变常用方法复盖突变部位的荧光双探针杂交，YIDDYMDDYVDD，46.9154 临床意义1 .免疫学检测敏感性： 0.1g/ml核酸杂交检测敏感性： 0.1pg/mlPCR检

11、测： 0.1fg/ml，能在感染早期通过DNA检测证明病毒的存在。 监测治疗效果：HBVDNA107复制/ml提示病毒复制活跃，HBVDNA104复制/ml治疗有一定的治疗效果38，4 .抗病毒乙肝病毒DNA聚合酶YMDD中的突变是病毒耐药性的重要原因，可以通过监测YMDD的突变情况，获取有关病毒耐药性的信息，指导抗病毒治疗。 39、二、流感病毒流行性感冒病毒(Influenzavirus )可分为引起流行性感冒的病原体甲(a )、乙(b )和丙(c )三种类型的病毒粒子表面凝集素(Haemagglutinin，HA )和诺甲型流感病毒容易发生变异，病原力强，1918年西侧发生的大流感杀死数千

12、万人，是因为甲型流感病毒。 rarer 16差异(h1toh 16 )和差异(n1ton9)； 有8个RNA片段或7个RNA片段。所有RNA片段5末端和3末端保守的2种不同的亚型病毒感染宿主时，生成转基因新病毒的RNA基因多在复制中发生突变。 (42，(二)分子诊断方法可以使用RT-PCR，FQ-PCR检测流感病毒RNA。 引物多是以流感病毒保守的非结构基因(NS )序列设计的。 为了证实PCR扩增产物的特异性，并提高检测灵敏度，采用限制性酶分析法、斑点杂交法、南方印迹法进行了扩增产物的分析。43，扩增位置引物序列扩增片段尺寸NS基因5-aaggctttcogaaggg-3190 (BP )5

13、- cccattctctactgcttc-3 ns基因5-atggccatcggatccaac-3241 (BP )5- t (3)临床意义流感病毒的诊断主要依靠鸡胚羊膜腔培养和血清学凝血抑制试验，但这些方法耗时、灵敏度低，难以早期诊断。 PCR法敏感、特异、简便、快速，且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。 45、3 .人类免疫缺陷病毒(HIV )、HIV、hummmamnodficiencyvirusadis、acquiredimmunodeficicysyndroehiv是艾滋病的病原体。 现在发现了艾滋病病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3三种。 1998年底艾滋病感染者和艾滋病患

14、者总数为3.340万人，已死亡1.390万人，是世界主要死因之一。 46，最外层是囊膜，双脂蛋白，是病毒攻击宿主细胞不可或缺的其中核衣壳。 47，48，2 .基因组结构逆转录病毒，两个拷贝的单链正链RNA； 各RNA的长度约9.7Kb，5个帽子，3端有多尾的HIV是变异剧烈的病毒。包含gag、env和pol个基因和6个控制基因tat、vif、vpr、vpx、nef、rev。 49、gag基因编码病毒核心蛋白质； pol基因编码病毒复制所需的酶类(逆转录酶、整合酶、蛋白酶) env基因编码的病毒包复蛋白质是HIV免疫学诊断的主要抗原。 控制基因编码辅助蛋白质，调节病毒蛋白质的合成和复制。(50，

15、(2)分子诊断方法，抗体的检测：酶免疫吸附法(ELISA )和免疫荧光检测法(IFA )感染两周后能产生病毒抗体的抗原的检测：酶免疫吸附法(ELISA )检测P24抗原，灵敏度低，51，1 .病毒的承载量目前常用的三种技术： RT-PCR最低检测限制50拷贝/mlbDNA最低检测限制50拷贝/mlNASBA最低检测限制20拷贝/ml，52， PCRRNA逆转录cDNA整合到宿主基因组中复制，以感染细胞DNA为模板PCR扩增的HIV是一种高变异病毒，不同患者体内分离的病毒基因结构有差异，引物设计应根据各编码区的保守序列设计的灵敏度高，特别是无症状的53、扩增位置引物序列扩增片段(bp ) gag基因5-gaacttatgcatgggtaaa-335325-ccagtaggaatctaaaa-3 gap基因5-ataatccacctatccaggagagagagagagagagagaatatatc-31155-ttgggtctttct 根据t cagatactctt-336505-gcaagcttatggcatccattcc-3，54，2 .病毒表型和耐药性检测，HIV表型主要是逆转录酶和蛋白酶基因突变检测最常用的耐药性检测方法是基因型检测病毒逆转录酶(RT )和蛋白酶(PI )基因的序列，将这些