0925酶化学0925

1、酶化学,燕山大学环境与化学工程学院,酶通论,酶的定义及研究过程酶催化作用的特点酶的化学本质及其组成酶的命名和分类核酶及抗体酶酶工程简介,燕山大学环境与化学工程学院,新陈代谢是生命的本能,生物体内每时每刻都有新的物质被合成，又有一些物质不断被分解，在这种物质合成与分解中又伴随着能量的贮藏与释放，这就是新陈代谢。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关。,燕山大学环境与化学工程学院,生物催化剂(biocatalyst),燕山大学环境与化学工程学院,酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质。核酶(ribozyme)：具有高效、特异催化作用的核酸

2、，主要参与RNA的剪接。,几个有关名词,底物(substrate,S)：酶作用的物质。产物(product,P)：反应生成的物质。酶促反应：酶催化的反应。酶活性：酶催化化学反应的能力。,人们对酶的认识过程,1833年，Payen和Persoz发现淀粉糖化酶(diastase)。巴斯德提出“酵素(ferment)”一词，认为只有活的酵母细胞才能进行发酵。1878年，Kuhne提出“Enzyme”一词，意为“在酵母中”。1896年，Buchner兄弟得到能催化发酵的无细胞滤液，证明发酵是一种化学反应，与细胞的活力无关。,燕山大学环境与化学工程学院,人们对酶的认识过程,1913年，Michaelis

3、和Menten提出酶促反应的动力学原理米氏学说。1926年，J.B.Sumner得到第一个酶结晶，并提出酶是蛋白质的观点。获得1947年诺贝尔奖。1982年，Cech发现四膜虫26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。,燕山大学环境与化学工程学院,酶催化作用的特点,酶与一般催化剂的共同点：在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只能加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,燕山大学环境与化学工程学院,酶作为生物催化剂的特点,酶易失活酶是由细胞产生的生物大分子，凡能使生物大分子变性的因素（高温、强碱、强酸、重金属盐等）都能使

4、酶失去催化活性。酶所催化的反应往往在比较温和的常温、常压和接近中性酸碱条件下进行。,燕山大学环境与化学工程学院,酶作为生物催化剂的特点,酶具有极高的效率酶的催化效率通常比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。酶加速反应的机理是降低反应的活化能(activationenergy)。,燕山大学环境与化学工程学院,酶促反应活化能的改变,活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。,燕山大学环境与化学工程学院,过氧化氢分解反应所需活化能,燕山大学环境与化学工程学院,酶作为生物催化剂的特点,酶具有高度专一性(specificity)一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键

5、，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种选择性称为酶的特异性或专一性。绝对特异性(absolutespecificity)相对特异性(relativespecificity)立体结构特异性(stereospecificity),燕山大学环境与化学工程学院,绝对特异性,酶只作用于特定结构的底物，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物。如：,燕山大学环境与化学工程学院,相对特异性,酶作用于一类化合物或一种化学键。如：,燕山大学环境与化学工程学院,立体结构特异性,酶仅作用于立体异构体中的一种。,燕山大学环境与化学工程学院,锁钥学说,酶作为生物催化剂的特点,燕山大学环境与化学工程学院,诱导契

6、合假说,酶作为生物催化剂的特点,燕山大学环境与化学工程学院,酶作为生物催化剂的特点,酶活性受到调节和控制调节酶的浓度通过激素调节酶活性反馈抑制调节酶活性抑制剂和激活剂对酶活性的调节其他调节方式,燕山大学环境与化学工程学院,酶活力,指酶催化一定化学反应的能力。在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。温度规定为25度，其他条件取反应的最适条件。比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是U/mg。比活越高则酶越纯。测定：一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定活力，因为此时干扰因素较少，速度保持恒定。反应速度的单位是浓度/单位时间，可用底物减少或产物增加的量来表示。因为产

7、物浓度从无到有，变化较大，而底物往往过量，其变化不易测准，所以多用产物来测定。,燕山大学环境与化学工程学院,酶的化学本质及其组成,酶的化学本质：除有催化活性的RNA之外几乎都是蛋白质。酶经酸碱水解后的最终产物是氨基酸，酶能被蛋白酶水解而失活凡使蛋白质变性的因素都可使酶变性失活酶是两性电解质，在不同pH下呈现不同的离子状态，在电场中想某一电极泳动，各自具有特定的等电点酶和蛋白质一样，具有不能通过半透膜等胶体性质酶也有蛋白质所具有的化学呈色反应,燕山大学环境与化学工程学院,据酶分子组成分类,单纯蛋白质酶类,结合蛋白质酶类,酶蛋白质,辅助因子,金属离子金属有机物小分子有机物,据酶蛋白特征分类,单体酶

8、（一条肽链）寡聚酶（两个或两个以上亚基）多酶复合体（几种酶非共价嵌合）,酶的化学本质及类别,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,金属酶(metalloenzyme)金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。金属激活酶(metal-activatedenzyme)金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。,燕山大学环境与化学工程学院,金属离子的作用：参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；稳定酶的构象；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用：参与酶的催化过程，在反应中传递电子、质子或一些基团。,辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为,辅酶(c

9、oenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,燕山大学环境与化学工程学院,一、命名：习惯命名；系统命名二、国际系统分类法及编号国际生物化学会酶学委员会（EnzymeCommsion）将酶分成六大类：1.氧还原酶类，2.移换酶类，3.水解酶类，4.裂合酶类，5.异构酶类，6.合成酶类每一种酶有一个编号，如乙醇脱氢酶EC1.1.1.27大类亚类亚亚类序号,酶的命名和分类,燕山大学环境与化学工程学院,核酶ribozyme,1982年，Cech研究发现，转录产物rRNA前体在鸟苷和Mg2+存在下切

10、除自身的413个核苷酸的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。此反应没有任何蛋白质酶催化，称为自我剪接，证明了RNA具有催化功能。,燕山大学环境与化学工程学院,核酶的种类,催化分子内反应的核酶(自我剪接和自我剪切)催化分子间反应的核酶核酶必须是RNA分子具有催化功能RNA的发现，表明RNA是一种既能携带遗传信息又有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA早于蛋白质和DNA，是生命起源中最早出现的生物大分子。,燕山大学环境与化学工程学院,抗体酶,抗体酶(abzyme)又称催化抗体(catalyticantibody)，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它

11、除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活化反应。,燕山大学环境与化学工程学院,抗体酶,抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过度态分子相结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过度态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能。达到催化反应的目的，这种具有催化功能的抗体就被称为催化抗体或抗体酶。,燕山大学环境与化学工程学院,B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态,C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物,

12、磷酸酯类似物(半抗原),对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体,免疫,免疫反应,诱导法制备具有酯酶活性的抗体,基因工程抗体酶的制备,对已产生的单抗，分析氨基酸的组成或相应基因的碱基序列，对抗体结合的部位的基因进行定位突变，在抗体结合部位换上有催化活性的氨基酸，基因工程的技术使得建立抗体基因的组合文库，并根据需要构建适当程序的基因片段成为可能。,燕山大学环境与化学工程学院,抗体酶的筛选,在抗体酶研究中，一个不可少的步骤是在细胞融合后筛选到能分泌催化抗体的细胞克隆。一般的方法是先筛选其抗体能结合特异抗原的细胞克隆，再从纯化的抗体中筛选出有催化能力的单抗。主要筛选方法有生物学筛选法和纯化学筛选法。,燕山

13、大学环境与化学工程学院,抗体酶的研究和应用前景,催化抗体的出现不仅为人们开创了一条人工设计酶的新方法，也使人们对催化过程中催化剂的作用机理和催化剂和底物的相互识别有了进一步认识。目前已经发现具有催化作用的自身抗体在生物体内的存在，其不仅和疾病相关，可能还参与了生物体内的某些或基本的生物学反应。有可能成为抗体酶研究的新热点。,燕山大学环境与化学工程学院,抗体酶的研究和应用前景,充分利用抗体的种类繁多以及抗体酶的可诱导、可改造的特点，可望制备出具有治疗和辅助治疗某些疾病或催化某类具有特殊意义反应的抗体酶。抗体酶的研究无疑会对化学、生物学、医学等领域产生深远影响。,燕山大学环境与化学工程学院,酶工程

14、简介,一、化学酶工程天然酶固定化酶化学修饰酶人工模拟酶二、生物酶工程克隆酶突变酶新酶,燕山大学环境与化学工程学院,将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzymeengineering)这样一个新的领域。酶工程主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。,固定化酶,将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物(或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶(immobilizedenzyme)。,共价偶联法,交联法,燕山大学环境与化学工程学院,溴化氰亚氨碳酸基偶联法,OH,OH,BrCN,H2O,O,O,C=

15、N-E,O-CO-NH-E,OH,O-C-NH-ENH,OH,H2N-E,（多羟基载体）,O-CONH2,OH,（惰性）,O,O,C=NH,（活泼）,OCN,OH,燕山大学环境与化学工程学院,戊二醛交联法,H2N-E,燕山大学环境与化学工程学院,酶的改造和模拟,酶的改造：功能基团的化学修饰酶酶蛋白侧链的化学修饰酶分子内或间的交联反应酶的模拟：根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构较简单,高效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小肽。,燕山大学环境与化学工程学院,人工模拟酶-benzyme,环糊精,催化侧链,催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝

16、乳蛋白酶,燕山大学环境与化学工程学院,生物酶工程,克隆酶：用基因工程技术大量生产酶。突变酶：对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶。新酶：设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。,燕山大学环境与化学工程学院,生物酶工程示意图,酶的蛋白质结构功能,新酶分子蓝图,选择性修饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA重组技术,DNA重组技术,燕山大学环境与化学工程学院,酶促反应动力学,化学动力学基础底物浓度对酶反应速率的影响酶的抑制作用温度对酶反应的影响pH对酶反应的影响激活剂对酶反应的影响,酶促反应动力学是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素。,燕山大学环境与化

17、学工程学院,一、化学动力学基础,反应速率及其测定反应分子数和反应级数各级反应的特征,燕山大学环境与化学工程学院,1.反应速率及其测定,反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。随着反应的进行，反应物逐渐消耗，分子碰撞的机会也逐渐渐小，因此反应速率也随着减慢（图9-1）。因为每一瞬间的反应速率都不相同，所以用瞬时速率表示反应速率。,燕山大学环境与化学工程学院,2.反应分子数和反应级数,反应分子数反应分子数是在反应中真正相互作用的分子数目。仅有一个反应的分子参加的反应为单分子反应。有两个反应的分子参加的反应为双分子反应。3个分子同时反应的几率很小。反应级数总反应速率与浓度的关系能以单分

18、子反应的速率方程式表示，为一级反应。以双分子反应的速率方程式表示，为二级反应。,燕山大学环境与化学工程学院,3.各级反应的特征,一级反应：反应速率与反应物浓度呈正比。二级反应：反应速率与反应物浓度的二次方（两种底物浓度的乘积）成正比。零级反应：反应速率与反应物浓度无关而受其他因素的影响而改变的化学反应。,燕山大学环境与化学工程学院,二、底物浓度对酶反应速率的影响,中间络合物学说酶促反应的动力学方程式多底物的酶促反应动力学,燕山大学环境与化学工程学院,1.中间络合物学说,在酶催化的反应中，第一步是酶与底物形成酶底物中间络合物。当底物分子在酶作用下发生化学变化后，中间复合物再分解成产物和酶。许多实

19、验事实证明了E-S络合物的存在。E-S复合物形成的速率与酶和底物的性质有关。,燕山大学环境与化学工程学院,ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到。许多酶和底物的光谱性在形成ES复合物后发生变化。酶的物理性质，经常在形成ES复合物后发生变化。已分离得到某些酶与底物相互作用生成的ES复合物。超离心沉降过程中，可观察到酶和底物的共沉降。,燕山大学环境与化学工程学院,2.酶促反应的动力学方程式,米氏方程及推导动力学参数的意义利用作图法测定Km和Vmax值,燕山大学环境与化学工程学院,米氏方程及推导,底物浓度对酶促反应速度的影响米氏方程米氏方程的推导,燕山大学环境与化学工程学院,底物浓度

20、对酶促反应速度的影响,在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,燕山大学环境与化学工程学院,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,燕山大学环境与化学工程学院,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,燕山大学环境与化学工程学院,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,燕山大学环境与化学工程学院,米氏方程,Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度,燕山大学环境与化

21、学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,2.动力学参数的意义,米氏常数的意义Vmax和k3（kcat）的意义kcat/Km的意义,燕山大学环境与化学工程学院,米氏常数的意义,Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关，所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。,燕山大学环境与化学工程学院,Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即k2k3，Km=Ks。在Km=Ks时，Km可表示酶和底物的亲和力。催化可逆反应的酶正

22、逆方向反应的Km是不相同的，测定细胞内Km和正逆方向反应的底物浓度，可大致推测正逆反应的效率，判断酶在细胞内的催化的主要方向。,燕山大学环境与化学工程学院,米氏常数的意义,3.利用作图法测定Km和Vmax值,VmaxSv=Km+S1Km11=+vVmaxSVmax,燕山大学环境与化学工程学院,双倒数作图法,-1/Km,1/Vmax,斜率=Km/Vmax,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,3.多底物的酶促反应动力学,双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类：,A+BP+Q,双底物双产物的反应,序列反应sequenti

23、alreactions,乒乓反应pingpongreactions,有序反应orderdreactions,随机反应randomreactions,燕山大学环境与化学工程学院,有序反应,E+A+BABEPEQE+P+QA为领先底物,燕山大学环境与化学工程学院,随机反应,特点是：底物A和B随机和酶结合，产物P和Q随机和酶脱离。,燕山大学环境与化学工程学院,乒乓反应（双置换反应）,双置换反应的特点是：酶同A的反应产物P是酶同第二个底物结合之前释放出来，相应的酶转变为E。再同底物B反应生成第二个产物Q，酶E转变为E。,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,三、酶的抑制作用,抑制程度

24、的表示方法抑制作用类型可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用动力学一些重要的抑制剂,能够和酶的必需基团结合，改变必需基团的结构和性质，酶未发生变性，从而引起酶活性的下降，甚至使酶的活性完全丧失的现象称酶的抑制作用。能引起抑制作用的物质称为抑制剂。,燕山大学环境与化学工程学院,1.抑制程度的表示方法,相对活力数vi/v0相对活力百分数（残余百分活力数）%vi/v0%抑制分数:指被抑制失去活力的百分数i=1-=1-(vi/v0)抑制百分数i%=1-%=1-(vi/v0)%,燕山大学环境与化学工程学院,V0为不加抑制剂时的反应速率Vi为加入抑制剂后的反应速率,2.抑制作用类型,抑制作用,可逆

25、抑制,不可逆抑制,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,燕山大学环境与化学工程学院,不可逆抑制,抑制剂与酶的必需基团以共价形式结合，引起酶的活行丧失。不能用透析、超滤等物理的方法除去抑制剂使酶复活。如有机磷毒剂二异丙基氟磷酸酯。,燕山大学环境与化学工程学院,可逆抑制,抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。,竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制作用,燕山大学环境与化学工程学院,1.竞争性抑制,某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶

26、促反应被抑制了。竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,*举例,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,燕山大学环境与化学工程学院,非竞争性抑制,酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,反竞争性抑制作用,酶与底物结合后抑制剂才能和酶

27、结合，反竞争性抑制作用常见于多底物反应。例：肼类化合物抑制胃蛋白酶。,燕山大学环境与化学工程学院,3.可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别,物理方法：用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。动力学方法：在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓度作图。,燕山大学环境与化学工程学院,燕山大学环境与化学工程学院,4.可逆抑制作用动力学,竞争性抑制作用非竞争性抑制作用反竞争性抑制作用不同类型可逆抑制剂米氏方程和常数,燕山大学环境与化学工程学院,+I,EI,ES,P+E,E+S,竞争性抑制作用,燕山大学环境与化学工程学院,竞争性抑制曲

28、线,燕山大学环境与化学工程学院,非竞争性抑制作用,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+）金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,燕山大学环境与化学工程学院,非竞争性抑制曲线,燕山大学环境与化学工程学院,反竞争性抑制作用,燕山大学环境与化学工程学院,反竞争性抑制曲线,燕山大学环境与化学工程学院,不同类型可逆抑制剂米氏方程和常数,燕山大学环境与化学工程学院,5.一些重要的抑制剂,不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂可逆抑制剂,燕山大学环境与化学工程学院,非专一性不可逆抑制剂,有机磷化合物有机汞、有机砷化合物重金属盐烷化试剂氰化物、硫化物和CO青霉素,燕山大学环

29、境与化学工程学院,专一性不可逆抑制剂,Ks型不可逆抑制剂（亲和标记试剂）抑制剂具有与底物相似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼的化学基团，能和酶分子中的必需基团结合，从而抑制酶的活性。活泼的化学基团也能和其他酶的基团结合而影响酶的活性，因而专一性并不是很高。,燕山大学环境与化学工程学院,专一性不可逆抑制剂,Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物）Kcat型抑制剂不但具有与底物相似的结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的反应，但抑制剂有一个潜在的化学基团，当酶对其催化时，潜在的化学基团被激活或暴露，作用于酶活性部位的必须基团或酶的辅基，使酶不可逆失活。特点是专一性特别高。,

30、燕山大学环境与化学工程学院,可逆抑制剂,可逆性抑制剂中最重要和最常见的是竞争性抑制剂。1.抗代谢物2.过渡态类似物,5氟尿嘧啶类似于尿嘧啶，影响核酸合成。对氨基苯磺酰胺类似于对氨基苯甲酸，影响叶酸合成。,过渡态底物是指底物和酶结合成中间产物后被活化的过渡形式，由于能障小，和酶结合的紧密，过渡态类似物和酶结合的能力远远高于底物，因此对酶有强烈的抑制作用。,燕山大学环境与化学工程学院,四、温度对酶反应的影响,一般来说，在一定范围内，温度升高，酶促反应速度加快；超过一定的温度界限，温度升高，酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。酶活性最高时的温度即为酶的最适温度。,燕山大学环境与化学

31、工程学院生物工程系,五、pH对酶反应的影响,酶对pH的变化极为敏感，每一种酶只在一定的pH范围内具有较高的活性，而且有一个最适pH。,燕山大学环境与化学工程学院生物工程系,五、pH对酶反应的影响,燕山大学环境与化学工程学院生物工程系,过酸过碱导致酶蛋白变性影响底物分子解离状态影响酶分子解离状态影响酶的活性中心构象,六、激活剂对酶反应的影响,凡能够提高酶活性，加速酶促化学反应的物质都称酶的激活剂(activator)。激活剂的类型无机离子如：Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Cr2+、Fe2+、Cl-、Br-、I-、CN-、NO3-、PO4-等；有机小分子如：EDT

32、A、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽生物大分子如：酶原激活时的蛋白酶,燕山大学环境与化学工程学院,酶的作用机制和酶的调节,酶的活性部位酶催化的独特性质影响酶催化效率的有关原因酶活性的调节同工酶,燕山大学环境与化学工程学院,一、酶的活性部位,酶活性部位的特点酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域，只有少数特异的氨基酸残基参与底物结合及催化作用。这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)。,燕山大学环境与化学工程学院,一、酶的活性部位,活性部位又分为：结合部位负责与底物的结合，决定酶的专一性。催化部位负责

33、催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。,燕山大学环境与化学工程学院,1.酶的活性部位的共同特点,活性部位通常只占整个酶分子体积的1%2%。酶分子的催化部位一般只有23个氨基酸残基组成。酶的活性部位是一个三维实体。酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补的，而是在酶和底物结合的过程中，底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的。“诱导契合”,燕山大学环境与化学工程学院,1.酶的活性部位的共同特点,酶的活性部位是位于酶分子表面的一个裂缝(crevice)内。裂缝内是相当疏水的区域。在裂缝内底物有效浓度可达到很高。底物通过次级键较弱的力结合到酶上。活性部位具有柔性或可运动性

34、。,燕山大学环境与化学工程学院,2.研究酶活性部位的方法,酶分子侧链基团的化学修饰法动力学参数测定法X射线晶体结构分析法定点诱变法,燕山大学环境与化学工程学院,酶分子侧链基团的化学修饰法,选择一种化合物，当它与酶作用时能专门与活性部位氨基酸残基侧链基团共价结合，然后将这个带标记化合物的酶水解，肽键被打开，但标记化合物共价键不被打开，因此可以分离得到带有标签的肽段，即可分析出活性部位的氨基酸残基，由此可确定活性部位在一级结构上的位置。缺陷：化学修饰有可能使活性部位之外的某个氨基酸残基的侧链改变，而影响酶分子的正常结构，因而导致酶活性的丧失。,燕山大学环境与化学工程学院,酶分子侧链基团的化学修饰法

35、,A.非特异性共价修饰某些化学试剂能和酶蛋白中氨基酸残基的侧链基团反应而引起共价结合、氧化或还原等修饰反应，使基团的结构和性质发生改变。B.特异性共价修饰某一种化学试剂专一的修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使酶失活。例：DFP标记在特定的丝氨酸残基上，使酶失活。,燕山大学环境与化学工程学院,酶分子侧链基团的化学修饰法,一些酶活性部位的氨基酸顺序,燕山大学环境与化学工程学院,酶分子侧链基团的化学修饰法,C.亲和标记(affinitylabeling)法合成的与底物结构相似的共价修饰物可以较专一地引入酶的活性部位，接近底物结合位点。具有活泼的化学基团可以与活性部位的某一基团结合形成稳定的共价键。利

36、用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记，故称亲和标记。试剂称“活性部位指示试剂”。,燕山大学环境与化学工程学院,定点诱变法,利用定点突变技术(sitedirectedmutagenesis),改变编码蛋白质基因中的DNA序列，研究酶活性部位的氨基酸。1987年，Craik将胰蛋白酶Asp102诱变为Asn102,酶活性降低5000倍。羧肽酶A中Tyr248原认为催化所必须，Tyr248的密码子（TAT）Phe(TTT)，kcat不变，Km高6倍。,燕山大学环境与化学工程学院,二、酶催化反应的独特性质,酶反应可分成两类：一类反应仅仅涉及到电子的转移，反应速率或转换数在108S-1数量级；另一类反

37、应涉及到电子和质子两者或其他基团的转移，反应速率在103S-1数量级。酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介的。主要的是His、Ser、Cys、Lys、Glu和Asp。酶催化反应的最适pH范围通常是狭小的。酶分子比底物大很多，而活性部位通常只比底物大一点。酶除了具有催化反应所必须的活性基团外，还有别的特性，使反应进行得更有力。,燕山大学环境与化学工程学院,三、影响酶催化效率的有关因素,酶和底物的邻近效应与定向效应酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变为分子内反应的过程。邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种反应。定向反应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。,燕山大学环境与化学工程学院,三、影响酶催化效率的有关因素,底物的形变和诱导契合当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，使底物分子发生形变。,燕山大学环境与化学工程学院,三、影响酶催化效率的有关因