实验10脂质体的制备

1、脂质体的制备和包封率的测定，沈阳药科大学药学教育实验中心，一、实验目的1，掌握胶卷分散法制造脂质体的技术。 2 .掌握用阳离子交换树脂测定脂质体包封率的方法。 3、精通脂质体的形成原理，具有作用特点。 4 .理解“能动药”和“被动药”的概念。 二、实验原理脂质体是由以磷脂和(或)加成剂为骨架的膜材制成的，是具有双分子层结构的封闭囊状体。 常见的磷脂分子结构有长的疏水烃链和亲水性基两种。 向水或缓冲溶液中加入适量的磷脂，磷脂分子取向，其亲水基面向两侧的水相，疏水性的烃链相互结合，形成双分子层，构成脂质体。 用于制造脂质体的磷脂，有大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等天然磷脂的合成磷脂，例如棕榈酰磷脂酰胆碱、

2、二硬脂酰二磷脂酰胆碱等。 经常使用的添加剂是胆固醇。 胆固醇也是两亲性物质，能与磷脂混合制成稳定的脂质体，其作用是调节双分子层的流动性，降低脂质体膜的渗透性。 其他添加剂有辛烷值、磷脂酸等，这些添加剂可改变脂质体表面的电荷性质，改变脂质体的包封率、内外稳定性、体内分布等其他相关参数。 脂质体的制备方法多种多样，可根据药物的性质和研究的需要进行选择。 (1)薄膜分散法是经典的制造方法，形成多室脂质体，经超声波处理得到小的单室脂质体。 该方法的优点是操作简便，脂质体结构典型，但包封率低。 (2)注入法有乙醚注入法和乙醇注入法等。 “乙醇注入法”是将磷脂等膜材料溶解在乙醇中，一边搅拌一边慢慢滴到含有

3、55-65种药的水性介质中，除去乙醇，继续搅拌12小时，从而形成脂质体。 (3)反相蒸发法将磷脂等脂溶性成分溶解于有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷中，与含药缓冲液以一定比例混合、乳化，减压蒸馏有机溶剂，形成脂质体。 该方法适用于制备水溶性药物、胰岛素等高分子活性物质脂质体，能提高包封率。 其他方法：冷冻干燥法、熔融法等。 在制造含药物脂质体时，根据药物的搭载机制，分为“能动药”和“被动药”。 “积极运送药物”是指以脂质体内外水相的不同离子和化合物的梯度运送药物，主要有K -Na梯度和h梯度(即pH梯度)等。 传统上，采用最多的方法是“被动药”法。 所谓“被动载体药”，首先在水相或有机相(脂溶性药物)

4、中溶解药物，按照选择的脂质体的制造方法制造含药物的脂质体，加载中脂质体的内外水相或双分子层膜上的药物浓度基本一致，决定其封入率的因素是药物和磷脂膜的作用力“被动药”法适用于脂溶性、与磷脂膜亲和性高的药物。 在两亲性药物中，油水分配系数受介质的pH值和离子强度的影响很大，封入条件的变化小时，封入率可能发生很大变化，因此最好采用“积极运药”的方法。 下图是示意性地表示“自主给药”中的pH梯度法的给药原理的图，h，d，DH，DH，insideacidpH，oudsidentineeutralph， 评价、，脂质体的品质的指标是粒径，粒径分布，包封率等。 其中脂质体包封率是测定脂质体内质量的重要指标。

5、 常见的包封率测定方法有分子筛法、速度离心法、超滤法等。 用阳离子交换树脂法测定了封入率。“阳离子交换树脂法”利用离子交换作用，像本实验的游离小檗碱那样，用阳离子交换树脂吸附除去不包含在正电荷的脂质体中的药物(即游离药物)，封入脂质体的药物(例如小檗碱)由于脂质体的负电荷而被阳离子交换树脂吸附示意图如下图所示。、Na SO-3，Na SO-3，Ber，Ber，Ber，、 /旋转蒸发器、烧瓶、恒温水浴锅、磁力搅拌器、吸耳球、光学显微镜、玻璃棉、5ml注射器、08m微过滤器、紫外分光光度计、体积瓶等。 (2)实验部1空白脂质体的制备(柱分离度测定用)【处方】注射适量大豆卵磷脂0.9g胆固醇0.3g

6、无水乙醇2-20m1磷酸缓冲液，制作约30m1脂质体，“(1)磷酸缓冲液(PBS )的制备是磷酸氢二钠(nbs )。 称量0.37g和磷酸二氢钠(NaH2PO42H2O)2.0g，加入适量蒸馏水，溶解在约1000ml(pH约5.7 )中稀释。 (2)将处方量的磷脂、胆固醇放入100ml(250ml、500ml或1000ml )烧瓶中，加入无水乙醇1-2ml (根据情况加入10ml或20ml )，放入65-70水浴中，搅拌使之溶解(将30 ml PBS取到别的烧杯中，放入65-70水浴中，保温，待机。 (4)取出预热后的PBS30ml，放入含有磷脂膜的烧瓶中，在65-70水浴中搅拌水合10-20

7、min。 将脂质体的液体取出到烧杯中，放置在磁力搅拌器上，在室温下搅拌30-60min，溶液的体积减少的话，可以向30m1补充水，使之混合。 (全过程可以用旋转式蒸发器完成，其他脂质体的制造也可以用旋转式蒸发器完成。 (5)采集，在油镜下观察脂质体的形态，画出可见的脂质体的结构，记录最多和最大的脂质体的粒径，然后使得到的脂质体溶液通过0.8m的微孔过滤器两次，整粒，再在油镜下观察脂质体的形态，观察【注意事项】(1)禁止通过实验使用火。 (2)磷脂和胆固醇的乙醇溶液要清晰，不要在水浴中长时间放置。 磷脂与胆固醇的比例可以采用4:1、5:1或6:1，磷脂与胆固醇的质量差时，推荐为6:1。 (3)由

8、磷脂、胆固醇构成的薄膜应尽可能薄。 (4)用4)60-65水浴搅拌水合10-20min时，必须充分确保所有脂质水合，不可存在脂质块。 2 .盐酸小檗碱脂质体的制备(被动载体法)【处方】注射用豆浆磷脂0.6g胆固醇0.2g无水乙醇2-20m1用盐酸小檗碱溶液(1mgm1)30ml制作脂质体，【制备】被动载体法(1)盐酸小檗碱溶液的(2)根据盐酸小檗碱脂质体的调制处方量，将豆磷脂、胆固醇放入100ml烧瓶中，加入无水乙醇，剩馀操作除了将PBS变成盐酸小檗碱溶液外，还可以用“空白脂质体的调制”即“被动载体法”调制的小檗碱【品质检查】观察粒子的形态、最大粒径和最大粒径、药物封入率。 【注意事项】同人。

9、 3 .盐酸小檗碱脂质体的制备(活性载体法)【空白脂质体处方】注射磷脂0.9g胆固醇0.3g无水乙醇2-20m1柠檬酸缓冲液30ml，制作约30ml的脂质体，【制备】活性载体法(1) 在空白脂质体的制造中，称取磷脂0.9g和胆固醇0.3g，加入无水乙醇，放入65-70水浴中，搅拌使之溶解，用旋转蒸发器旋转，使磷脂的乙醇液在壁上成膜，减压除去乙醇。加入30ml相同温度的柠檬酸缓冲液，在6570水浴中水化为10-20min，将脂质体取出至烧杯中，剩下的操作与“1空白脂质体的制备”相同。 (2)积极载药，准确量取空白脂质体2.0ml、药液(3mgm1)1.0m1、NaHCO3溶液0.5m1，在振荡下

10、依次放入10ml瓶子混合，盖上盖子，在70水浴中保温(定时振荡) 20min，然后用冷水冷却【注意事项】(1)“积极运药”过程中，上药的顺序一定不能逆转。 加入3种液体时，应随着摇晃确保混合的均匀性，保证系统中各部位的梯度一致。 (2)水浴保温时，请注意随时轻轻摇动，保证系统均匀即可，不需要剧烈摇动。 (3)用冷水冷却期间，请轻轻摇动。 【品质检查】观察粒子的形态、最大粒径和最大粒径、药物封入率。 【备注】(1)柠檬酸缓冲液是将10.5g柠檬酸和7g柠檬酸钠放入1000ml的瓶子中，加水溶解，稀释为1000ml，混合而成。 (2)NaHCO3溶液被称为NaHCO350g，放入1000ml的瓶子

11、中，加入水溶解，稀释成1000m1，混合后得到。 4 -盐酸小檗碱脂质体封入率的测定(1)阳离子交换树脂分离柱的制备取适量经处理的阳离子交换树脂，放入底部铺有少量玻璃棉(或多孔质垫片)的5ml注射器筒中(总量约4ml刻度)，将用PBS水合后的阳离子交换树脂(2)柱分离度的考察盐酸小檗碱和空白脂质体的混合液的制备：精密量取0.1ml盐酸小檗碱溶液，放入试管中，加入空白脂质体0.2ml，混合。 对照品溶液的调制：将得到的混合液0.1ml加入到10ml瓶中，加入95乙醇6ml，摆动溶解，将PBS加入到刻度中，均匀摆动，过滤，丢弃初滤液，继续10ml瓶滤液4.0ml，将PBS加入到刻度中，均匀摆动样品

12、溶液的调制：采集中调制的混合液从0.1m1到分离柱的顶部，放置5min，直到柱顶部的液体消失，小心地加入PBS (请注意不要冲洗柱顶部的离子交换树脂)，采集溶出液(需要约23ml的PBS )的同时，溶出加入95乙醇6ml，摇动溶解，PBS加入刻度中，均匀摇动过滤，丢弃初滤液，采集滤液作为样品溶液。 空白溶剂的制备：取50m1乙醇(95 )，放入50m1瓶中，加入PBS刻度，均匀摇晃后，马上就能得到。 吸收率测定：以空白溶剂为对照，在345nm波长下测定样品溶液和对照溶液的吸收率，计算柱分离度。 分离度的要求大于0.95。 柱分离度=1A样品/(A对2.5 )式中，a样品溶液的吸收率； 吸收度2.5对照品溶液相对于a对照品溶液的稀释倍数。 注意：在进行柱分离度实验前，需要用空白脂质体使分离的柱饱和。 具体操作，称量0.2ml的空白脂质体，放在分离的柱顶部，柱顶部液体消失后，用5mlPBS充分溶出，液滴用尽即可。 (3)封入率的测定是精确测量2个盐酸小檗碱脂质体，一个放入10ml瓶子中，用柱分离度的考察项目操作，另一个用柱分离度的考察项目操作，得到的溶液用345nm波长测定吸收率，用下式计算封入率。 封入率()=(Al/At)100式中，Al为分离柱后，收集脂质体中盐酸小檗碱的吸收率的At盐酸小檗碱脂质体中的总药物吸收率，A