核酸检测实验室的规范化管理ppt课件

1、(一)临床基因扩增检测实验室区域设置原则1临床基因扩增检测实验室原则上可分为四个工作区域：试剂贮藏和准备区域； 标本制备区扩增反应混合物的制备和扩增区； 扩增产物分析区。 (使用全自动分析装置时，区域可以适当合并) 2必须在各作业区域上做明确的标记，防止不同作业区域内的设备物品混合存在。 3进入各个工作区域，必须严格地在单一方向上进行。 即试剂贮藏和准备区标本调制区的扩增反应混合物调制和扩增区扩增产物分析区。 4按每个作业区域区分使用作业服(颜色等)。 工作人员离开各作业区域时，不得带出工作服。 (2)作业区域机器配置标准1试剂储藏准备区域2-8和-15冰箱混合器； 微取样器(霸盖1-1000

2、l )移动紫外线灯(靠近桌面)消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和取样器的吸口(带元件)专用工作服和工作鞋专用办公用品。 2标本调制区1-8冰箱、-20或-80冰箱； 高速台式冷冻离心机混合器； 水浴箱或加热模块微取样器(霸盖1-1000l )可动紫外灯(靠近桌子面)处理洁净桌子消耗品一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和样品芯片(带元件)专用工作服和工作鞋专用办公用品大分子DNA 3 .扩增反应混合物的制备和扩增区核酸扩增装置； 微取样器(霸盖1-1000l )可动紫外灯(靠近桌面)消耗品(一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和样品芯片(带元件)专用工作服和

3、工作鞋专用办公用品.4.放大产物分析区的基本器械设备如下：微量样品.(3)各区操作注意事项是在该区进行储藏试剂的调制、试剂的分注和主反应混合液的调制。 本区实验工作要戴手套，经常更换。 操作中使用一次性帽子也是有效的污染防止措施。 严禁用喷嘴吸液体，取样器和吸引头必须在高压下处理。 工作一结束就要马上打扫工作空间。 实验室及其设备的使用需要日常记录。 1、试剂贮藏和准备区，2 .标本制备区，以下操作为标本保存、核酸(RNA，DNA )的提取、贮藏和添加到扩增反应管中和测定RNA时cDNA的合成。 为了避免样品间的交叉污染，有必要在加入测定的核酸后，复盖含有反应混合液的反应管。 有潜在感染危险性

4、的材料需要明确的样品处理和灭活程序。 样品处理对核酸扩增影响很大，必须使用有效的核酸提取方法。 3 .在该区进行放大区、DNA或RNA放大。 嵌套PCR测定中，通常第一次放大后必须打开反应管，因此嵌套放大的危险性很高，第二次采样必须在本区进行。 不得从本区进入“上游”区域。 降低本区的气压，防止气溶胶从本区泄漏。 为了避免气溶胶造成的污染，尽量减少在本区行走。 4 .扩增产物分析区，以下操作在本区进行：扩增片段的测定。 因为本区是最主要的扩增产物污染源，所以要注意不要通过本区的物品和工作服带走扩增产物。 该地区可能使用基因突变和有害物质，如溴化乙烯、丙酰胺、甲醛和同位素等，要注意实验者的安全防

5、护。本区采用负压或减压时，扩增产物从本区扩散到前区的可能性减少，二、质量保证、临床基因扩增检查实验室的质量保证涉及基因扩增检查的全阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析及测定后的结果报告等。 (1)标本的采集(2)标本的稳定化处理(3)标本的输送(4)标本的储存(5)标本的处理(核酸提取) (6)目标核酸的逆转录CFIT )和扩增(7)污染(8)扩增产物的分析(9)质量控制，(1)标本的采集、基因扩增检查中常用的临床标本是EDTA和柠檬酸采集血液等样品时，请使用像真空采血管一样的一次性密闭容器。 在使用非密闭采样系统时，要注意防止采样者的皮屑和分泌物污染，如尿、分泌

6、物和骨髓采样等。 取样时必须戴一次性手套. 玻璃器具在使用前请进行高压处理。 临床上用于RNA (如HCVRNA )扩增检测的血液标本建议进行抗凝固处理，尽快(3小时内)分离血浆避免RNA分解。 如果要进行抗凝固处理，采血后，血清必须在1小时内分离。 (二)用于标本稳定化处理、DNA扩增检查的标本必须立即送到实验室。 用于RNA测定的标本应进行稳定化处理，异硫氰酸酯(Guanidinethiocyanate，CITC )可以使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采样标本时，以1:4的比例含有血清和血浆等标本材料5molLGITC (3)标本的运送，标本采集后，必须尽快送到实验室。 经过稳定化处理

7、的标本可以在常温下邮寄。 用于RNA检查的标本，如果不进行稳定化处理，必须在速冻后，放入干冰进行输送。 (4)标本的储藏，临床体液标本，如血清血浆等可在-70下长期储藏。 用于DNA测定的精制核酸样品可以在10mmolLTris1mmolLEDTA缓冲液(pH7.58.0 )中保存4个。 用于RNA测定的精制核酸样品必须储藏在缓冲液中的-80或液氮中。 用乙醇沉淀的核酸样品贮藏在-20中即可。 用GITC处理的RNA标本可以在室温下保存7天。 (5)标本的处理(核酸提取)、标本的处理，即核酸提取纯化是决定扩增检查成功与否的重要步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板之前，必须充分评

8、价其提取的有效性。 目的核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是，检体运送前未进行足够的稳定化处理，核酸提取试剂的RNA酶的污染。 建议使用高品质的商品核酸提取试剂。 (6)目标核酸的逆转录(RT )和扩增，一个目标RNA的逆转录通常影响cDNA合成的效率： (1)逆转录效率降低或完全不足。 其可能的原因是逆转录酶的品质不高，试剂的分解变质，样品有错误等(2)逆转录用的标本中存在逆转录或Taq酶的阻碍物(酚、氯仿、血红素等) (3)RNA酶的存在会引起RNA的分解。 2核酸扩增有很多引起核酸扩增检测假阳性和假阴性结果的因素，如扩增目标核酸中的抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度差、Mg2

9、浓度差、患者标本和试剂被污染等。 放大器孔的热传导均匀性极为重要，需要定期检查放大器的温度控制和加热模块的热传导均匀性，避免假阴性结果。(7)污染在实际工作中，常见扩增片段的污染(产物污染)、天然基因组DNA的污染、试剂污染(贮藏液和工作液)、标本间的交叉污染(气溶胶从阳性标本扩散到原阴性标本等)。 临床基因扩增检测实验室污染的最主要原因是扩增产物的污染。1分析前测量污染源2分析阶段测量污染源3污染回避作业区的严格划分的目的是防治污染。 为了避免以前测定产生的放大产物的污染，可以设法破坏。 如果用放大反应将dTTP的一部分置换为dUTP，照射持续的长波紫外光，就无法取代严格的实验室设置和管理。

10、 特别是这些方法不能防止外来非放大的天然DNA污染。 4去除污染的措施：次氯酸钠、紫外线照射、高压消毒、(8)扩增产物的分析、扩增产物的测定有多种方法，如电泳、限制性酶切除、斑点迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等，临床PCR检测项目基本上使用探针杂交方法杂交检查时必须严格遵守商品试剂盒决定的杂交处理盒的杂交条件。(9)质量控制必须对DNA和RNA分析的各个阶段进行质量控制，避免假阳性和假阴性，保证测定结果的正确性和再现性。 由于核酸扩增测定敏感性高，标本的制备、逆转录、扩增本身和产物分析都需要质量控制措施。 现在的商品套件大部分没有用标准的方法进行质量控制。 因此，在测定血清/血浆病原体核酸，如HBVDNA、HCVRNA等时，必须使用已知的弱阳性