沉淀法幻灯片.ppt

1、第六章沉淀法,1,加入沉淀剂，改变溶剂和溶质的能量平衡，降低溶质的溶解度，使其离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出。,沉淀技术是一个广泛应用于生物产品（特别是蛋白质）下游加工过程的单元操作。它能够起到浓缩与分离的双重作用。,2,沉淀法的优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中沉淀越有利，收率越高。,沉淀法的缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质。,3,应用沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取，无论是实验室规模还是工业生产，沉淀法都得到了普遍应用。,4,沉淀法分离蛋白质的特点使原料液体积减小1050倍，简化生产工艺、降低生产费用；使中间产物保持在一个中性温和

2、的环境；可及早将蛋白从其与蛋白酶混合的溶液中分离出来，避免降解，提高产物稳定性；用沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降到最低。,5,蛋白质的溶解特性,蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。,6,蛋白质的组成,与蛋白质分子稳定化有关的力和相互作用包括共价键交联、疏水效应、氢键、范德华力和静电相互作用。,7,蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其表面大部分是亲水的，但是其内部大部分是疏水的。亲水和疏水区域的分布和程度决定了蛋白质在水相环境中的溶解程度。各个氨基酸所呈现的疏水程度是不相同的，其中苯丙氨酸被认为是最疏水的，而精氨酸则是最亲水的

3、。,8,影响蛋白质溶解度特性的另一个因素是它的大小。小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。,蛋白质的大小,9,蛋白质的溶解度还取决于所处环境的物理化学性质。溶剂(例如水)的可利用度是至关重要的，同时这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子等的相互作用(包括在蛋白质表面的溶剂化作用)，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数变化的影响。,蛋白质所处的环境,10,由于改变蛋白质性质较难，故对其溶解度的调控，常常是通过改变溶液的性质来实现的。,影响蛋白质溶解度的因素,11,当溶液中蛋白质超过了溶解度时，液相中的蛋白质分子处于过饱和状态，不再全部溶剂化

4、，在其相互作用下沉淀逐渐增多并凝聚在一起以保持一个稳定的构型，这是一个排斥溶剂分子的过程。蛋白质在这样的沉淀中，是以一种刚性的、稳定的状态存在，这种状态又可通过溶解度的重新调整，恢复到原先的溶剂化形式。,12,沉淀法的选择原则沉淀剂是否会引起蛋白质分子的破坏沉淀剂本身的性质沉淀操作的成本和难易程度残留沉淀剂的去除难度最终产品的产率纯度的要求,13,蛋白质沉淀方法,加入中性盐盐析；加入可溶性有机溶剂；将pH值调节到等电点；加入非离子型亲水性聚合物；加入聚电解质絮凝；加入多价金属离子。,14,中性盐盐析法,在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低电位，即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白

5、质所带的电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。,15,16,蛋白质的盐析行为常用Cohn经验式表示：（6-1）式中S为蛋白质的溶解度；为离子强度，等于1/2miZi2；mi为离子i的摩尔浓度；Zi为离子i所带电荷；为常数，与盐的种类无关，但与温度和pH值有关；Ks为盐析常数，与温度和pH值无关。,17,在浓盐溶液里，蛋白质溶解度的对数值与溶液中离子强度成线性关系，但是由于离子强度在盐析情况下较难测定，只有在离子完全离解，即稀溶液时才能有效分析，所以式(7-1)并不十分准确，因而常用浓度代替离子强度，则上式变为：（6-2）式中m为盐的摩尔浓度；

6、常数Ks和分别为盐析曲线的斜率和Y轴截距。,18,值为蛋白质在纯水中即离子强度为零时的假想溶解度对数值，是pH值和温度的函数。Ks与温度和pH值无关，但和蛋白质及盐的种类有关。,盐析曲线,19,盐析法分离蛋白质的常用方法在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks”分级盐析法。在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。,一般粗提蛋白时常用第种方法，进一步分离纯化时常用第种方法。,20,常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠，硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，硫酸钠虽无腐蚀性但低于40就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的

7、蛋白质的沉淀过程。磷酸钠与磷酸钾也常用于蛋白质沉淀过程，但它们的价格较昂贵。至于其他盐类的沉淀效果都比硫酸铵差。,21,在蛋白质盐析时，可以加入固体盐，也可以加入盐的饱和溶液来改变蛋白质溶液的盐浓度使其沉淀，其盐浓度可以表示为饱和百分率。25时，硫酸铵的饱和浓度为4.1mol/L（即767g/L硫酸铵溶液），定义它为100%饱和度，为了达到所需要的饱和度，应加入固体硫酸铵的量，可由下表查出。,22,硫酸铵饱和度的配制表（25）,23,对于加入固体盐，其需用量也可按下式计算：(6-3)式中X为每升溶液中加入固体盐的数量(g)；G为饱和溶液中的盐含量(g/L)；S1为初始盐浓度(百分数)；S2为所

8、需盐浓度(百分数)；V为在饱和溶液中盐的表观比容。,24,若使用饱和溶液，则加入的体积用下式计算：（6-4）式中Y为1L溶液中，使盐浓度从S1变为S2时所需加入的饱和溶液体积。,25,等电点沉淀法,蛋白质的离子化既与蛋白质的结构有关，也与溶液的pH值有关。,当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，或者说它带相等的正电和负电，这时的pH值称为等电点（pI），等电点处蛋白质的溶解度最小。,26,蛋白质等电点沉淀法就是基于不同蛋白质离子，具有不同等电点这一特性，用依次改变溶液pH值的办法，将杂蛋白沉淀除去，最后获得目标产物。,27,等电点沉淀法中的pH值作用于值而隐含在Cohn公式

9、中，pI值通常在pH46范围内变化，一般用无机酸(如盐酸、磷酸和硫酸)作沉淀剂。,等电点沉淀法的缺点是无机酸会引起较大的蛋白质不可逆变性的危险。,28,有机溶剂沉淀法,许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。如同盐析一样，随着沉淀剂（有机溶剂）浓度的上升，蛋白质溶解度也呈指数规律下降。,29,有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。当蛋白质的空间结构发生变形超过一定程度时，便会导致完全的变性。,30,不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受蛋

10、白质种类、温度、pH值和杂质等因素所影响，但大致上以丙酮为最佳，乙醇次之，甲醇更次。其中乙醇是工业上最常用的沉淀剂。,31,沉淀过程中应控制好的参数,温度当乙醇与水混合时，会放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，对不耐热的蛋白质影响较大。生产上常用搅拌、少量多次加入的办法，以避免温度骤然升高损失蛋白质活力。另一方面，温度会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。,32,乙醇浓度通常随着乙醇浓度的上升，蛋白质溶解度下降。,pH值在确定了乙醇浓度以后，蛋白质的最低溶解度出现在蛋白质的等电点处，因此可以通过调节pH值来选择性分离蛋白质。,蛋白质浓度应避免使用很稀的浓度，因为蛋白质

11、在高浓度下才比较稳定。,33,有机溶剂沉淀法的优点某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂。,34,缺点：需要耗用大量的溶剂，而溶剂的来源、贮存都比较困难或麻烦，并且沉淀操作需在低温下进行，使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。,35,非离子型聚合物沉淀法,许多非离子聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和葡聚糖等都可用于沉淀蛋白质，其中最常用的是PEG。相对分子质量从200到20000的不同聚合程度的PEG产品都是有效的，通常在蛋白质沉淀中使用PEG-6000或PEG-4000。,36,

12、PEG沉淀作用的机理是基于体积不相容性，即PEG分子在溶剂中排斥蛋白质分子，优先水合的程度取决于PEG的分子大小和浓度，排斥体积与PEG分子大小有关，这些因素与被分离的蛋白质无关。蛋白质在溶解度上的差别取决于蛋白质分子的相对大小和蛋白质-蛋白质分子间的相互作用，这种相互作用是因为PEG的空间排斥作用使蛋白质浓度增加而产生的。,37,PEG沉淀分离蛋白质的优点体系的温度只需控制在室温条件下；沉淀的颗粒往往比较大，同其他方法相比，产物比较容易收集；PEG非但不会使蛋白质变性而且可以提高它的稳定性。,38,PEG沉淀分离蛋白质的缺点PEG比其他沉淀剂更难从蛋白质溶液中除去，为此需用超滤和液-液萃取来

13、解决。,39,聚电解质沉淀法,聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物。可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。,40,聚电解质的沉淀作用与其分子大小、电荷密度以及蛋白质的净电荷有关。蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。,41,影响沉淀过程的因素有溶液pH值、反离子的类型和浓度，以及聚电解质的量，若聚电解质过量，将导致蛋白质重新溶剂化。,42,金属离子沉淀法,金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与组胺酸残基中的咪唑基结合，使蛋白质的等电点转移，从而降低蛋白质的溶解度。,43,金属离子沉淀蛋白质一般分为三类,第一类为能与羧基、胺基等含氮化合