CP2005无菌检测

1、无菌检查法附录h无菌检查法无菌检查法系指检查药品、敷料、缝合线、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其他品种是否无菌的一种方法。无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验证。生物制品的无菌检查，应按中国生物制品规程中有关无菌检查的规定办理。培养基及其制备方法培养基应适合需气菌、厌气菌或真菌的生长，可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。以下培养基制备时，均以115灭菌30分钟。1.需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐流体培养基)酪胨（胰酶水解）15g氯化钠2.5g葡萄糖5g新配制的0.1刃天

2、青溶液1.0mll胱氨酸0.5g(或新配制的0.2亚甲蓝溶液0.5ml)硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.50.7g(或硫乙醇酸0.3ml)水1000ml酵母浸出粉5g除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节ph为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节ph值使灭菌后为7.10.2，分装，灭菌。在供试品接种前,培养基指示剂氧化层的颜色不得超过培养基深度约1/5，否则,须经水浴煮沸加热,只限加热一次。2.真菌培养基胨5g磷酸氢二钾1g酵母浸出粉2g硫酸镁0.5g葡萄糖20g水1000ml除葡萄糖外，取上述成分加入水内，微温溶解后，调节ph值约为6.8，煮沸,加葡萄糖溶解

3、后，摇匀，滤清，调节ph值使灭菌后为6.40.2，分装，灭菌。3.选择性培养基(1)对氨基苯甲酸培养基（用于磺胺类药物的无菌检查）照上述需气菌、厌气菌培养基及真菌培养基的处方及制法，各加对氨基苯甲酸0.125g，溶解后，摇匀,分装,灭菌。(2)聚山梨酯80培养基（用于油剂药品的无菌检查）照上述需气菌、厌气菌培养基及真菌培养基的处方及制法，各加10ml聚山梨酯80，摇匀，分装，灭菌。4.营养肉汤培养基胨10g肉浸液1000ml氯化钠5g取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节ph为弱碱性，煮沸，滤清，调节ph值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。5.营养琼脂培养基照上述营养肉汤培养基的处方及制

4、法，加入1520g琼脂，调节ph值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。6.0.5葡萄糖肉汤培养基胨10g葡萄糖5g氯化钠5g肉浸液1000ml取胨和氯化钠加入肉浸液内，微温溶解后，调节ph为弱碱性，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节ph值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。7.真菌琼脂培养基照真菌培养基的处方及制法，加入1520g琼脂，调节ph值使灭菌后为6.40.2,分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。上述培养基分别按15ml与40ml或需要量分装于试管功其他容器中，装量约为试管或容器高度的2/5，按规定的温度和时间灭菌。细菌培养基经3035培养48小时,真菌培养基经2025培养72小时后

5、，应无菌生长。【附注】肉浸液制备法取新鲜牛肉，除去肌腱及脂肪，切细，绞碎后，每1000g加水3000ml，充分拌匀，在210浸泡2024小时，煮沸1小时，滤过，压干肉渣,补足液量，分装，灭菌，置冷暗处备用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml，配成溶液代替。培养基质量应通过灵敏度检查。培养基灵敏度检查法1.菌种(1)藤黄微球菌(micrococcusluteus)cmcc(b)28001(2)生孢梭菌(clostridiumsporogenes)cmcc(b)64941(3)白色念珠菌(candidaalbicans)cmcc(f)980012.操作(1)取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠

6、菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物,分别用0.9无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液；将生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸入无菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用0.9无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。分别取上述菌悬液,用0.9无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度,然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10100个菌并计数。(2)将藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物,白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释,制成1ml中含10100个菌并计数。将藤黄微球菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml

7、的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为12ml的需气菌、厌气菌培养基3管,白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀释菌液各1ml,接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管,以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。3.结果判定以每株菌接种后的培养基不得少于2管呈现生长，即该培养基的灵敏度检查符合要求。对照用菌液1.金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）菌液取金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内,在3035培养1618小时后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释

8、至每1ml中含10100个菌。2.生孢梭菌（clostridiumsporogenes）菌液取生孢梭菌cmcc(b)64941的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳,接种至相同培养基内，在3035培养1824小时，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10100个菌。3.白色念珠菌（candidaalbicans）菌液取白色念珠菌cmcc(f)98001的真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至真菌培养基内，在2025培养24小时后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10100个菌。抑细菌和抑真菌试验在用直接接种法无菌检查前，可用如下方法测定供试品是否具有抑细菌和抑真菌作用。用需

9、气菌、厌气菌培养基4管及真菌培养基2管，分别接种金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、白色念珠菌均10100个菌各两管，其中1管加供试品规定量，所有培养基管置规定的温度，培养35天。如培养基各管24小时内微生物生长良好，则供试品无抑菌作用。如加供试品的培养基管与未加供试品的培养基管对照比较，微生物生长微弱、缓慢或不生长，均判为供试品有抑菌作用。该供试品需用稀释法（种入较大量培养基中）或中和法、薄膜过滤法处理，消除供试品的抑菌性后，方可接种至培养基。检查法无菌检查法包括：直接接种法和薄膜过滤法。前者适用于非抗菌作用的供试品，后者适用于有抗菌作用的或大容量的供试品。操作时，应用适当的消毒液对供试品容器表面或外

10、包装浸没或擦拭消毒后，以无菌的方法取内容物。凡无菌检查中，均应取相应溶剂和稀释剂同法操作，作阴性对照。1.直接接种法(1)供试品准备供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液，按表1或表2规定量取供试品，混合。供试品如为注射用无菌粉末或无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，按表1或表2规定量取供试品，加入无菌水或0.9无菌氯化钠溶液,或该药品项下规定的溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液。供试品如为外科敷料，取供试品4个包装,以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪取约100mg或1cm3cm的供试品11份；肠线、缝合线取最小包装5个，拆开包装，共取11股，接种于足以浸没供试品的

11、适量培养基中。供试品如为灭菌医用器具，依样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以浸没供试品的适量培养基中。或用0.9无菌氯化钠溶液各40ml，分别冲洗内壁（输血、输液袋）收集各冲洗液，混合，按薄膜过滤法检查。供试品如为青霉素类药品，按表1或表3规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合。亦可按薄膜过滤法检查。供试品如为放射性药品，取供试品1瓶（支），接种于装量为7.5ml的培养基中。每管接种量为0.2ml。2.操作取上述备妥的供试品,以无菌操作将该供试品分别接种于需气菌、厌气菌培养基6管，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml，作阳性对照,另接种于真

12、菌培养基5管。轻轻摇动,使供试品与培养基混合。需气菌、厌气菌培养基管置3035、真菌培养基管置2025培养7日。在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24小时内应有菌生长，如在加入供试品后，培养基出现浑浊，培养7天后,不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或斜面培养基上继续培养，细菌培养2日，真菌培养3日，观察是否再出现浑浊或斜面有无菌生长，或用接种环取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌。2.薄膜过滤法如供试品有抗菌作用，按表1或表3规定量取供试品，按该药品项下规定的方法处理后,加入0.9无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶剂至少100ml中,混合后，通过装有孔径不大于0.45m的薄膜过滤器，然后用0.9无菌氯化钠溶液或其他适宜的溶液冲洗滤膜至阳性对照菌正常生长。将需气菌、厌气菌培养基，真菌培养基用阳性对照管用培养基分别加至薄膜过滤器内（封闭式过滤器），或取出滤膜分成3等份,分别加入上述二种培养基中，按规定温度和时间培养。阳性对照管应根据供试品特性加入相应对照菌液1ml(抗细菌药物，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗厌氧菌药物，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌药物，以白色念珠菌为对照菌)。阳性对照管