色层分离法-课件

1、色层分离法,概述,历史,1906年俄国植物学家Michael Tswett首次发现,层析法,色谱法,层离法,石 油 醚,色层分离的基本原理,色层系统组成,固定相,流动相,固定不动的物质称作固定相(固体或液体),推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体,利用混合物中各组分物理化学性质的差异使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。,吸附力 分子形状及大小 分子亲和力 分配系数,色层分离的基本原理,性质,色层分离法基本原理,层析分离分类,按溶质分子与固定相相互作用机理,吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力） 分配层析（溶质在两液相间分配系数不同）

2、 凝胶过滤（分子大小与形状） 亲和层析,层析分离分类,按操作形式不同分类：,柱层析： 纸层析： 薄层层析：,层析分离分类,根据流动相分类,气相层析 液相层析 超临界流体层析,根据压力分类,低压（小于0.5 Mpa) 中压 (0.5-5 Mpa) 高压 (5-40 Mpa),色层分离的基本概念,分配系数,Kd-分配系数 q、c-溶质在固相和液相中的浓度,体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,阻滞因素,色层分离的基本概念,洗脱体积,色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积,不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,色层分离的基本概念,两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比,分离度,

3、塔板理论,迁移,平衡,吸附层析技术,原理,利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。,吸附层析技术,氧化铝,应用：有机溶剂中分离天然成分,硅胶,聚酰胺,固定相,分配层析技术,利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法,固定相 载体 流动相,要素,分配层析技术,载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶,分配层析技术,固定相,C-18、C-8烷基链,流动相,正相分配层析,反相分配层析,水、稀硫酸、甲醇,极性溶剂,非极性溶剂,凝胶层析法,基本原理,分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。,凝胶层析法,凝

4、胶层析法,凝胶层析法,优点： 操作简便 分离效果好，重复性高，回收率高 分离条件温和 应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐,缺点：,处理量小 稀释,凝胶理化性质,排阻极限 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量,分级范围 指当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围,床体积 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积,空隙体积 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间,凝胶理化性质,粒度： 操作,粗(相当于50目) 中(100目) 细(200目) 极细(300目),溶胀,装柱,加样,洗脱,凝胶层析法,蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关,LogM=k1-k2Ve,凝

5、胶层析法,凝胶的种类和性质,交联葡聚糖凝胶（Sephadex),葡萄糖分子间主要是-1,6-糖苷键 交联剂：1-氯-2，3-环氧丙烷,凝胶层析法,琼脂糖凝胶,-D-吡喃半乳糖 3，6脱水-L-吡喃半乳糖,凝胶层析法,琼脂糖凝胶,-D-吡喃半乳糖 + 3，6-脱水-L-吡喃半乳糖,聚合,离子交换层析,原理,以离子交换剂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法,阳离子交换层析过程,离子交换树脂,蛋白质,高离子强度洗脱液洗,高离子强度洗脱液洗,加样,平衡液洗,收集,离子交换层析,一CH2SO3H,活性基团,一SO3H,-COOH,-OH (酚羟基）,离子

6、交换层析,二乙基胺乙基,活性基团,常用的离子交换剂,葡聚糖凝胶型 Sephadex 纤维素系列离子交换剂 Sephacel Cellex系列 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B,离子交换层析,1,2,3,4,6,7,8,9,10,5,pH,pH pI（-）,吸附阳离子交换剂,吸附阴离子交换剂,等电点,蛋 白 质 净 电 荷,+,-,离子交换介质的选择原则,离子交换层析,样品洗脱,10,20,30,40,50,60,70,80,90,恒定洗脱,阶段洗脱,梯度洗脱,离子强度,pH值,离子交换层析,疏水作用层析,在载体表面连接疏水基团，可以与蛋白质的某些疏水

7、基团相互作用，从而实现多组分的分离。,疏水性,分离依据,疏水作用层析,吸附剂： 配体：苯基C6，辛基C8，烷基C18 介质：硅胶、树脂如phenyl、 sepharose FF 、 sepharose CL-4B,（1）Pr表面的疏水补丁。（2）Pr局部变性，暴露疏残基。 （3）高盐浓度下 Pr表面疏水表面与固定相结合。 1mol/L(NH4)2SO4,2mol/LNaCl,原理：,疏水层析操作,利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术,亲和层析,纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高,应用范围受限,特点,配体,蛋白质,蛋白质和配体复合物,亲和层析,具有特异性亲和作用的生物分子,抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 激素或药物与其受体 糖蛋白与其相应的植物凝集素,亲和层析,葡聚糖凝胶,纤维素,琼脂糖凝胶,其它新型载体,聚丙烯酰胺凝胶,常用的亲和层析载体,亲和层析配基的选择,条件就要强烈，这样可能使生物分子变性,配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物,分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配,基与生物分子之间的亲和力,纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力,但亲和