半固态蔬菜发酵方法的研究

1、半固态蔬菜发酵方法的研究学生常姣 指导老师燕平梅（太原师范学院生物系，山西 太原 030031）摘 要: 为了探明矮花叶基因插入玉米植株后，其在萌发过程中某些生理生化指标的变化，以及其是否影响亲本玉米自身的代谢产物的含量。本试验以转基因矮花叶玉米种子为材料，测定其发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数；芽期淀粉酶、蛋白酶活性和可溶性糖、可溶性蛋白含量以及苗期过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和叶绿素含量的变化。结果显示：转基因矮花叶玉米上述物质的活性或含量均高于对照转基因玉米，表明外源基因的导入没有影响上述物质的合成和代谢。关键词: 转基因矮花叶玉米 发芽指标

2、 酶活力玉米为粮、饲兼用的主要作物之一，在世界农业生产上有着举足轻重的地位。我国为世界第二大玉米生产国，对玉米的需求与日俱增1。然而玉米在生长期间容易受多种病虫害的严重危害而使其产量和品质下降，特别是受各种病毒侵染造成病毒性退化。全世界有40多种病毒侵染玉米，其中以玉米矮花叶病毒(Maize Dwarf Mosaic Viurs)分布最广，危害最严重2。利用基因工程手段，可选育出转基因矮花叶玉米品种，改善玉米抗矮花叶病的能力。如刘小红等利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因(MDMVCP)导入玉米优良自交系，后代对玉米矮花叶病呈现不同程度的抗性。转基因玉米所带来的优势勿庸置疑，但其安全性一直

3、都是人们关注的焦点。一是基因扩散造成基因污染问题。玉米是靠风力授粉，所以很容易授粉给非转基因作物，从而造成品种混杂。抗性转基因玉米还有可能将抗性基因转至环境中的野生植物群中，增加其抗虫、抗病毒、抗逆性，使其成为难以控制的杂草，甚至由于超强的适应性，有可能造成生态平衡的破坏。二是对人体健康造成影响的问题。标记基因(尤其是用抗生素基因作标记)可能会发生基因的“水平转移”，从而对人体产生负面影响，如抗生素抗性基因与人体内病原物发生“异源重组”，则会降低抗生素在临床医疗过程中的有效程度。一些基因在转移过程中，有可能获得某些蛋白的合成指令，导致人体过敏反应1。此外由于在转基因操作中对外源基因的插入位点尚

4、无准确控制以及外源基因与植物基因组之间可能存在各种复杂的相互作用，可能会产生各种非预期效应，这些非预期效应可以引起植株代谢产物的含量和营养成分发生变化甚至会减少3。到目前为止，前人对转基因矮花叶玉米遗传和抗病性方面的研究不少4，但对其生理生化指标的研究报道较少。为了探明矮花叶基因插入玉米植株后，其在萌发过程中某些生理生化指标的变化，以及其是否影响亲本玉米自身的代谢产物的含量，为转基因矮花叶玉米的育种提供试验依据。本试验以转基因矮花叶玉米种子为材料，测定其发芽率、发芽势、发芽指数；淀粉酶、蛋白酶、CAT、POD、SOD活性以及可溶性糖、可溶性蛋白和叶绿素含量的变化。1. 材料与方法1.1 试验材

5、料抱头白1.2 主要仪器设备 人工气候培养箱：青岛海尔特种电冰柜有限公司、风光光度计、鼓风干燥箱（FN101_1A型）：长沙仪表厂、高速台式离心机（TGL_16B）、磁力加热搅拌器（HJ_1）：郑州长城科工贸有限公司、电热恒温水浴锅：青岛海尔特种电冰柜有限公司、电子天平（0.1mg）。1.3 方法1.3.1 蔬菜前期处理 取100克白菜16份于透明熟料袋，做以下处理：预发酵1：先以8%食盐均匀涂与蔬菜表面腌制（三天）后将腌制菜洗（煮沸放凉的水）干净，沥干水分，涂上发酵辅料1%（w/w）的食盐、1%（w/w）的白糖、1%（w/w）的虾酱、3%（w/w）的辣椒粉、1%（w/w）的蒜、1%（w/w）

6、的葱，将塑料袋密封。预发酵2：先以8%食盐均匀涂与蔬菜表面腌制（三天）后将腌制菜洗（煮沸放凉的水）干净，沥干水分，涂上发酵辅料1%（w/w）的食盐、1%（w/w）的白糖、1%（w/w）的虾酱、3%（w/w）的辣椒粉、1%（w/w）的蒜、1%（w/w）的葱、30%（w/w）的淀粉糊，将塑料袋密封。直接发酵1：直接在蔬菜表面涂上发酵辅料10%（w/w）的番茄酱、10%（w/w）的葡萄糖、20%（w/w）的虾酱、6%（w/w）的食盐，将塑料袋密封。直接发酵2：直接在蔬菜表面涂上发酵辅料10%（w/w）的番茄酱、10%（w/w）的葡萄糖、20%（w/w）的虾酱、6%（w/w）的食盐、30%（w/w）的

7、淀粉糊，将塑料袋密封。两种发酵方法发酵一周、两周、三周、四周测定发酵蔬菜硝酸盐含量、亚硝酸盐含量、乳酸菌数量、大肠杆菌数量、PH、及发酵蔬菜的感官评价。1.3.2 生理生化指标测定 泡菜中亚硝酸盐的测定准备称取4g试样，置于研钵中，研碎后用14mL水转移到50mL烧杯中，滴加2%NaOH溶液调节样品酸度至pH8，定量转移至50mL容量瓶中。滴加0.42mol/LZnSO4溶液约（0.6mL）混匀，至产生白沉淀。置60水浴中加热10min，取出后冷却至室温，加水稀释至刻度，混匀。放置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液4mL，收集继续过滤的滤液待测。吸取0、0.20mL、0.40mL

8、、0.60mL、0.80mL、1.00mLNaOH标准使用液（含0、1.00ug、2.00ug、3.00ug、4.00ug、5.00ugNaNO2），分别置于25mL具塞比色管中，加入4.50mLNH4Cl缓冲液、2.50mL60%乙酸溶液后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，暗处静置25min，用1cm比色皿，在波长550nm处测其吸光度。绘制标准曲线或按公式求出线性回归方程。吸取10.0mL上述滤液于25mL具塞比色管中，加入4.50mLNH4Cl缓冲液、2.50mL60%乙酸溶液后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，暗处静置25min，用1cm比色皿，在波长550nm处测

9、其吸光度。 泡菜中硝酸盐的测定方法准确称取4g试样，置于研钵中，研碎后用18.5mL水转移到50mL烧杯中，滴加2%NaOH溶液调节样品酸度至pH8，定量转移至50mL容量瓶中。滴加0.42mLmol/LZnSO4溶液约（0.6mL）混匀，至产生白沉淀。置60水浴中加热10min，取出后冷却至室温，加水稀释至刻度，混匀。放置30min，用滤纸过滤，弃去初滤液4mL，收集继续过滤的滤液待测。用流动分析仪测定硝酸盐。计算：单位为每克泡菜所含的毫克 即 mg/kg 计算方法：分析仪测的数据mg/L*0.05L/5g*1000=测的数据*10mg/kg PH的测定从每瓶发酵

10、蔬菜中取其卤液，用pH计测其pH，连测三次，求得平均值。 食盐浓度的测定吸取10.00mL泡菜卤液注入250mL锥形瓶中，加40mL水及5滴铬酸钾指示液（5%），混匀。用硝酸银标准液（0.10mol/L）滴定至初现砖红色，记录消耗的硝酸银标准溶液体积，同时做试剂空白试剂。 乳酸菌的计数乳酸菌的计数用选择培养基MRS。以适宜的稀释度涂布泡菜卤于MRS和加入15%的琼脂平板，在37培养箱中培养48小时。MRS培养基成分：蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，聚山梨醇酯80.0g,柠檬酸二钠2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.1g，

11、硫酸锰0.05g，硫酸二氢钾2.0g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。调培养基PH6.50.2,121灭菌20分钟。 大肠杆菌的计数大肠杆菌用结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBDA）平板，接种后置于37厌氧培养24h后计数。VRBDA培养基：酵母提取物3.0g，蛋白胨7.0g，氯化钠5.0g，3号胆盐1.5g，乳糖10.0g，中性红0.03g，结晶紫0.002g，蒸馏水1000mL，琼脂16g。制法：将各成分加入蒸馏水中，加热煮沸，各成分完全溶解，调节PH至7.40.1.冷却至45倒入灭菌平皿，冷却到室温可用。2. 结果与分析 采用Excel对试验数据进行处理，应用SPSS10.0统计

12、软件分析转基因玉米与非转基因玉米各个生理指标之间的差异，差异显著水平用0.01P0.05，差异极显著水平用P0.01表示。2.1 发芽指标表 1 转基因矮花叶玉米发芽指标的变化Table 1 Transgenic maize dwarf mosaic germinates the target changes玉米种子发芽率（%）发芽势（%）发芽指数（）此括号里是空的吗？Gi活力指数（）VI非转基因玉米（678）77.5%69.0%274.033288.31转基因玉米93.5%85.5%358.804305.57注： *和*分别为经方差分析与对照有显著（0.01P0.05）和极显著(P0.01)

13、差异 转基因矮花叶玉米发芽指标的变化如表1所示。从表中可看出，转基因玉米的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均不同程度的高于对照非转基因玉米的，但各项指标的差异均不显著（p0.05）。2.2 萌发期转基因矮花叶玉米淀粉酶活性的变化图 1 萌发期转基因矮花叶玉米淀粉酶活性的变化Figure 1 During germination Starch enzyme vigor changes of Transgenic maize dwarf mosaic图中横纵坐标字体,图例的字为小五号.黑体.以下同.转基因矮花叶玉米在萌发期淀粉酶活性的变化如图1所示。通过三个时间定点的测定发现，在正常萌发条件下，

14、随着萌发天数的增加，转基因玉米与对照非转基因玉米的淀粉酶活性总的变化趋势都是逐渐降低，且萌发过程中前者淀粉酶活性始终比后者高。在萌发的第3天，转基因玉米的淀粉酶活性比非转基因玉米的增加了86.71%，二者差异达显著水平（0.01P0.05）。随着萌发天数的增加，二者淀粉酶活性均迅速下降。在萌发的第5天、第7天，与非转基因对照相比，转基因玉米的淀粉酶活性分别增加了173.27%、345.14%，差异极显著（P0.01）。从图1还可得知，从第3天到第5天二者淀粉酶活性的下降幅度均比第5天到第7天的大。2.3 萌发期转基因矮花叶玉米蛋白酶活性的变化图 2 萌发期转基因矮花叶玉米蛋白酶活性的变化Fig

15、ure 2 During germination Proteinase vigor changes of Transgenic maize dwarf mosaic 萌发期转基因矮花叶玉米蛋白酶活性的变化如图2所示。通过三个时间定点的测定发现，在正常萌发条件下，萌发期转基因玉米的蛋白酶活性始终比非转基因玉米的高。在萌发的第3天，转基因玉米的蛋白酶活性比非转基因玉米的增加了66.66%,二者差异显著（0.01p0.05）；萌发第7天与第5天类似，二者酶活性差异不显著（p0.05）。在萌发的第3天到第5天，与非转基因玉米蛋白酶活性下降幅度相比，转基因玉米蛋白酶活性下降幅度较大。从图2还可得知，与淀

16、粉酶活性的变化类似，在萌发的第3天到第5天，二者蛋白酶活性的下降幅度均比第5天到第7天的大。2.4 萌发期转基因矮花叶玉米可溶性总糖含量的变化 此部分放在实验方法。图 3 麦芽糖标准曲线Figure 3 Malt sugar specification curve图 4 萌发期转基因玉米可溶性总糖的变化Figure 4 During germination total Soluble sugar changes of Transgenic maize dwarf mosaic麦芽糖标准曲线见图3。由图3可见，麦芽糖含量与吸光值成正相关，相关系数高达0.9899。萌发期转基因矮花叶玉米可溶性总糖

17、含量的变化如图4所示。通过三个时间定点的测定发现，在正常萌发条件下，随着萌发天数的增加，二者可溶性总糖含量都呈上升趋势，且增长幅度基本相当，但转基因玉米的可溶性总蛋白含量始终比非转基因玉米的高，二者可溶性总糖含量没有显著差异（p0.05）。2.5 萌发期转基因矮花叶玉米可溶性总蛋白含量的变化图 5 小牛血清蛋白含量标准曲线 放在实验方法。Figure 5 calf serum albumin content specification curve图 6 萌发期转基因矮花叶玉米可溶性总蛋白含量的变化Figure 6 During germination total Soluble protein

18、 changes of Transgenic maize dwarf mosaic小牛血清蛋白含量标准曲线见图5。由图5可见，蛋白浓度与吸光值成正相关，相关系数达0.9566。转基因矮花叶玉米可溶性总蛋白含量在萌发期的变化如图6所示。通过三个时间定点的测定发现，在正常萌发条件下，随着萌发天数的增加，转基因玉米与非转基因玉米可溶性总蛋白含量的变化趋势类似，均在萌发的第5天时上升，第7天时又下降，但前者的可溶性总蛋白含量始终比后者的高。在萌发的第3天，转基因玉米可溶性总蛋白含量比非转基因玉米的高5.59%，二者差异不显著（p0.05）。随着萌发天数的增加，二者可溶性总蛋白含量均增加，且增加幅度都不

19、大。到萌发的第5天，二者可溶性蛋白含量均达到阈值，转基因玉米可溶性总蛋白含量比非转基因玉米的高11.11%，二者差异不显著（p0.05）。之后随着萌发天数增加，二者总蛋白含量均下降，到萌发第7天，二者可溶性总蛋白含量差异甚小。2.6 苗期转基因矮花叶玉米与叶片中叶绿素含量的变化表 2 转基因矮花叶玉米叶片中的叶绿素含量变化Table 2 chlorophyll content changes In leaf blade of Transgenic maize dwarf mosaic 叶绿素种类叶绿素含量（mg/g）非转基因玉米转基因玉米叶绿素a0.911.25叶绿素b0.290.41叶绿素a

20、+b1.201.66叶绿素a/b3.113.02转基因矮花叶玉米叶片中叶绿素含量的变化如表2所示。由表可知，转基因玉米叶片中的叶绿素a、b、ab的含量均比非转基因玉米的高，分别增加了37.36%、41.38%、38.33%，差异均不显著。与非转基因玉米相比，转基因玉米叶绿素a/b的含量下降了2.98%。2.7 不同时期转基因矮花叶玉米保护酶活性的变化表 3 转基因矮花叶玉米保护酶活性的变化Table 3 Protection enzyme vigor changes of Transgenic maize dwarf mosaic 酶类保护酶活性芽期苗期非转基因玉米转基因玉米非转基因玉米转基因

21、玉米CAT（U/gmin）2.392.886.488.44POD（U/gmin）29.4329.5962.0576.30SOD（U/mg蛋白）73.7175.92109.69123.15图 7 不同时期转基因矮花叶玉米CAT活性的变化Figure 7 During different times CAT active changes of Transgenic maize dwarf mosaic 不同时期转基因矮花叶玉米与非转基因玉米CAT活性的变化见表3和图7。在正常条件下，无论是芽期还是苗期，转基因玉米与非转基因玉米CAT活性之间没有显著差异（p0.05），但在两个不同时期内，前者的CA

22、T活性均比后者的高，分别增加了20.50%、30.25%。从图7还可得知，转基因玉米芽期和苗期的CAT活性相比，增加了193.06%，而非转基因玉米的增加了171.13%，均达极显著水平（p0.01）。 图 8 不同时期转基因矮花叶玉米POD活性的变化Figure 8 During different times POD active changes of Transgenic maize dwarf mosaic 不同时期转基因矮花叶玉米与非转基因玉米POD活性的变化见表3和图8。在芽期，转基因玉米与非转基因玉米POD活性的差异甚小，前者的POD活性略高于后者。在苗期，转基因玉米的POD活性

23、比非转基因玉米的增加了22.97%，二者差异不显著。从图8还可得知，与CAT活性的变化类似，转基因玉米芽期和苗期POD的活性相比，增加了157.86%，而非转基因玉米的增加了110.84%，均达极显著水平（p0.01）。图 9 不同时期转基因矮花叶玉米SOD活性的变化Figure 9 During different times SOD active changes of Transgenic maize dwarf mosaic 不同时期转基因矮花叶玉米与非转基因玉米SOD活性的变化见表3和图9。与CAT活性的变化类似，在芽期，转基因玉米与非转基因玉米SOD活性的差异甚小，前者的SOD活性仅

24、比后者高3%。在苗期，转基因玉米的SOD活性比非转基因玉米的增加了10.93%，二者差异不显著（p0.05）。转基因玉米芽期和苗期SOD的活性相比，增加了62.21%，而非转基因玉米的增加了48.81%，均达显著水平（0.01p0.05）。3. 讨论本试验利用转基因矮花叶玉米与非转基因玉米对照分析了玉米种子的发芽指标、可溶性总糖、可溶性总蛋白和叶绿素含量、以及几种酶活力的变化。种子的发芽指标在一定程度上可显示其萌发活力的大小10。本试验结果表明，转基因矮花叶玉米的发芽势、发芽率、均高于非转基因玉米对照。说明前者玉米种子的萌发活力优于后者。淀粉酶和蛋白酶是玉米种子萌发过程中最主要的水解酶。萌发中

25、种子内贮藏的大分子物质淀粉和蛋白质分别经淀粉酶和蛋白酶水解后形成小分子物质，被转运至胚根、胚芽供生长之用11。玉米种子萌发过程中，淀粉酶活性与胚乳消耗速率成正相关，为胚形成新组织和发芽提供能量12。本试验结果表明，萌发的转基因矮花叶玉米种子的淀粉酶和蛋白酶活性都高于对照非转基因玉米的，且在萌发的第3天，二者淀粉酶或蛋白酶活性的差异显著。在萌发条件相同，采样亦代表一种均匀群体效应的情况下，转基因矮花叶玉米种子的淀粉酶和蛋白酶活性间的差异可能是由于转入矮花叶基因的缘故。试验结果还表明，无论是转基因矮花叶玉米还是非转基因玉米，从萌发的第3天到第5天，其淀粉酶或蛋白酶活性的下降幅度均比第5天到第7天的

26、大。暗示玉米萌发的最佳时期为第3天第5天。可溶性糖和可溶性蛋白是构成一切生命活动的主要物质11。可溶性糖类是很多植物的主要渗透调节剂，也是合成其他有机溶质的碳架和能量来源，对细胞膜和原生质胶体起稳定作用13。本试验结果表明，在萌发过程中，转基因矮花叶玉米的可溶性总糖和可溶性总蛋白含量均高于对照非转基因玉米的含量。说明转基因玉米比非转基因玉米的生命活动旺盛。研究表明：SOD、CAT和POD是植物内清除活性氧自由基最关键的保护酶14。SOD构成细胞内的第1道防线，催化超氧阴离子歧化为H2O2和O2并降低其对膜脂的过氧化程度15。CAT主要存在于过氧化物体中，通过清除H2O2而控制细胞的活性氧水平，

27、保护细胞膜的完整性16。POD存在于细胞溶质中，可清除植物体内的H2O217。本试验结果表明，无论是芽期还是苗期，转基因矮花叶玉米的SOD、CAT和POD活性均不同程度的高于对照非转基因玉米。说明转基因矮花叶玉米在芽期和苗期的抗逆性优于对照非转基因的。试验结果还表明，无论是转基因矮花叶玉米还是非转基因玉米，其SOD、CAT和POD活性在芽期和苗期之间的差异均显著。说明玉米植株在生长到苗期后，才可能会形成一套完整的保护酶系统或抗氧化酶系统。叶绿素a和叶绿素b分别是高等植物光和作用的主要色素和辅助色素，其含量在一定程度上体现了光合作用的大小14。本试验结果表明，转基因矮花叶玉米的叶绿素a和叶绿素b

28、的含量均不同程度的高于对照非转基因玉米。说明转基因矮花叶玉米的光和能力优于非转基因玉米对照。另外，与非转基因玉米相比，转基因玉米叶绿素a/b的含量下降了2.98%。表明矮花叶基因的导入对叶绿素b的促进生成作用比叶绿素a的大。 综上所述，转基因矮花叶玉米在发芽指标、淀粉酶、蛋白酶、CAT、POD和SOD活性以及可溶性总糖、可溶性蛋白和叶绿素含量方面均不同程度地优于对照非转基因玉米。说明转基因矮花叶玉米在种子萌发和幼苗抗逆性以及幼苗光和作用的能力方面均优于对照非转基因玉米，且转基因玉米在这些生理生化指标上没有影响亲本玉米自身的代谢产物的含量。据此推测，转基因矮花叶玉米在整个生长过程中的生长状态和抗

29、逆性等方面均有明显优势，这将有利于转基因矮花叶玉米的育种应用和开发利用。参考文献1刘源霞,兰进好,杜景平,等.转基因玉米研究进展.山东农业科学,2007(6):234236.2马丽.玉米矮花叶病及抗病毒基因工程研究进展.玉米科学,2008,16(1):137140.3唐茂志.转高赖氨酸蛋白基因玉米食用安全性评价及致命性评价模式研究.2006:10.4杜建中,孙毅,王景雪,等.转基因抗矮花叶病玉米的遗传、表达及抗病性研究.生物技术通讯.2008,19(1):4346.5方能虎,洪法水,赵贵文.稀土元素对水稻种子萌发活力、吸水量和膜透性的影响.稀土,2000,21（4）:5254.6王秀奇,秦淑媛

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