分选型流式细胞仪.ppt

1、FACSAria分选型流式细胞仪,BD公司生物科学部,BD公司简介,BD是由Maxwell W.Becton和Fairleigh S. Dickinson于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。 经过100多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。 BD一直是全球最专业、产品线最全的流式细胞仪生产商和流式技术领导者。全球市场占有率达到80，中国市场占有率达到85%。,BD公司流式细胞仪,FACSCalibur,LSRII,FACSCantoII,Influx,FACSAriaII,Accu

2、ri C6,LSRFortessa,FACSVerse,FACSJazz,BD FACSAriaII分选型流式细胞仪,2008年最新产品 集多种专利技术和完美设计,流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种快速、准确、客观的同时检测直线流动状态中单个颗粒多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，并可以对特定群体加以分选。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物及人工合成微球等。 流式细胞仪(Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,基本概念,液流系统 光学系统 电

3、子系统 数据储存与分析系统 分选系统,流式细胞仪组成,Fluidics Cart,Cytometer,液流系统,AIR PRESSURE,BULK INJECTION,Sheath Tank,AIR PRESSURE,ASPIRATED WASTE (VACUUM),ASPIRATED WASTE (DEGAS),SHEATH FILTER,Sheath Regulator,Sample Regulator,V17,V20,V5,V6,液流系统,样品流速的选择,低流速：一般用于分辨率较高的分析，如DNA分析 高流速：一般用于定性分析，如免疫分型。采集速度快，影响分型。,光学系统,光信号,11,

4、前向角散射光信号,侧向角散射光信号,荧光信号,Fluorochromes Overview,1,2,3,电子系统,光电转换器：将光信号转换成电信号 光电二极管 光电倍增管（PMT）,放大器两种放大方式： 线性放大（lin） 对数放大（log）,线性放大：按光强度的线性关系输出信号。用于FSC，SSC， 细胞周期检测，SP细胞检测及分选等。,对数放大：按光强度的对数关系输出信号。用于大多数荧光染色实验。,电脉冲信号类型： 高度信号H 宽度信号W 面积信号A,细胞周期中粘联体区分,Area,Height,Threshold,阈值,用于屏蔽噪音信号和碎片信号，只有高于等于阀值道数的信号才会被送入计算

5、机进行处理。,模拟数字转换器,数据储存与分析系统,数据储存,39,271,39,271,Event 1,Event 2,Event 3,FSC,SSC,FITC,PE,0,60,120,89,10,160,65,30,650,160,List-Mode Data,89,675,30,621,PE-A,FITC-A,675,Time,PE-A,FITC-A,May be exported as FCS file,39,271,22,688,30,621,6,189,FITC/PE双染样本,数据显示,直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot） 等高线图（Contour Plot）

6、密度图（Density） 三维图（3D Plot）等,直方图：显示单一参数（横坐标）与通道细胞个数（纵坐标）。一条竖线代表一个细胞信号，多竖线累加形成峰图，一个峰即一类细胞。 二维点图：一个点代表一个细胞信号。 等高线图：可显示数据信号的疏密程度。 密度图：可显示信号分布的疏密程度。 三维图（3D Plot）等,Aria II的喷嘴位于检测点的下方，因此更换喷嘴后无需重新调整激光光路,1检测,2充电,3偏转,4收集,分选系统,分析结果精准：需要高灵敏度和分辨率-石英杯流动池 分选细胞纯度：需要对目标细胞的准确定位-Accudrop和Sweetspot技术 分选速度：保证纯度前提下高度分选-分选

7、速度70 ,000个细胞/秒 分选后活性：需要整个系统各环节对细胞的保护-石英杯流动池，自动无菌管路清洗，温控 仪器性能状态稳定性：质控程序的监控和调整-CS&T仪器质控程序及仪器状态监控,流式细胞仪分选要素,高灵敏度-弱表达样本检测,Dim staining PE population visible,Dim staining,高灵敏度稀有样本检测,待测细胞细胞群的比例 并不总是这么高,有时，很低,十万分之一,此时，灵敏度和分辨率至关重要,传统透射光路 采用长通/短通滤光片 光信号经过一次透射，信号损失15-20% 多色分析时，荧光检测灵敏度降低,八角形/三角形接收装置-BD专利 采用全反射

8、双色光镜 光信号经过一次反射，信号损失仅5% 保证多色分析时的荧光检测灵敏度,光电倍增管,带通滤光片,长通双色反光镜,细胞通过激光束的流速变慢，激光照射时间更长，提高了激光激发效率 流动池被光胶耦合在荧光接收物镜上，提高了荧光收集效率，保证多色应用中最佳的灵敏度和分辨率 固定光路，无需每日调节，机器随开随用，减少人为可变性，提高实验重复性,石英杯流动池,开机光路无需调整 一键式操作 无需操作者的丰富经验 实验结果的可重复性好,实测检测灵敏度：FITC: 10 MESF PE:10 MESF,实测分辨率：CV=1.6%,二极管激光器，安装在分选模块装置左侧 可以提供侧液流图像的照相机 用于观察B

9、D AccudropTM 微球荧光的发射光滤光片,Accudrop微球是一种荧光微球，被位于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前方的滤光片，用于测量drop delay。该系统由下列部分构成：,定义：Drop delay即液滴延迟时间，指细胞通过检测区到液滴分离的间隔时间,意义： Drop delay如果能够被准确确定，就可以保证包裹细胞的液滴表面不会充上相反的电荷，从而实现最高的分选纯度及细胞得率,耗时：0.5到1.5小时 辅助材料：荧光微球、荧光显微镜、 玻片、计算器,传统液滴延迟时间确定,BD 独有专利 Accudrop 技术： Accudrop微球是一种荧光微球，被位

10、于偏转板下方的红激光激发后，发射光可以透过侧液流监视器前方的滤光片，用于测量drop delay。,预先分选Accudrop荧光微球 自动准确设置最佳液滴延迟时间 无需手动调节，减少人为误差 保证实验的分选纯度和得率,Sweet Spot自动监控功能,液滴断点监测窗口 自动调节振幅，维持断点稳定 维持最佳液滴延迟状态 仪器阻塞报警，保护分选样本不受污染，实现分选时无人看管,分选模式,Yield Mask：如果目标颗粒位于该设定范围内，则含有目标颗粒的液滴和相邻的液滴都被分选。,Purity Mask：如果非目标颗粒位于该设定范围内，则与其相邻的含有目标颗粒的液滴将不被分选。,Phase Mas

11、k：如果目标颗粒位于该设定范围内，则含有目标颗粒的液滴将不被分选。,影响分选细胞的活性的因素：,细胞本身 激光功率 液路系统（喷嘴） 分选系统的洁净程度及温度控制,石英杯激发保证了用小功率激光的效率远远大于大功率空气激发的效率，光毒性小，很好的保证细胞活性。,稳定而零剪切力液流系统设计最大程度的保证了细胞的活性，同时专利的喷嘴设计，进一步保证了细胞活性。,既有样本温控系统也有收集仓温控,Aria 自动无菌消毒清洗 软件向导清洗自动执行 无菌分选结果保证，文献支持,全自动标准化的无菌清洗流程，密闭式的上样和分选收集仓，执行一次可以保证整个管路系统在以后连续4天内菌量为0的最佳效果。,采用一管CS

12、&T微球，方便检测 微球染料可以被任意激光激发，涵盖常用染料荧光波谱 自动调整PMT 报告仪器性能参数：Qr，Br，CV，跟踪仪器状态 自动调整激光延迟和面积因子 BD公司专利技术,Cytometer Setup & Tracking System,CS&T仪器质控程序及仪器状态监控,流式细胞术操作流程,样品制备 流式染色、检测 数据分析,细胞悬液的制备,单细胞悬液（天然，机械研磨/消化） 51051106cells/ml，约0.51ml，300目筛网过滤,阴性对照：自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。 同型对照：自发荧光非特异荧光，使用与一抗相同

13、种属来源、相同亚型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合产生的背景染色 实验样本：自发荧光特异荧光非特异荧光 补偿对照：双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时，使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色，纠正荧光素发射光谱重叠，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号,设置对照及染色,用同型对照或阴性对照管调节电压使阴性群位于“左下角” 用单阳性管依次调节相邻荧光之间补偿，如 FL1-%FL2， FL2-%FL1,染色体分选 单克隆细胞分选 肿瘤干细胞分选 转染细胞分选 免疫或免疫相关细胞分选 ,细胞生理学研究 细胞膜表面标记 细胞内标记

14、 细胞周期分析 凋亡分析 ,流式细胞术的应用,细胞生理学研究 细胞相对大小和颗粒性分析,细胞生理学研究 细胞内PH值检测,细胞生理学研究 Ca2+流动性检测：Ca2+是非常重要的细胞内离子，在细胞膜到细胞浆的信号传导中起重要的作用。细胞受到刺激后，胞内Ca2+浓度会发生改变。 最常用的染料：Indo-1,Fluo-3,Fura red,细胞生理学研究 细胞活性分析：Fluorescein Diacetate进入活细胞后，被胞内酯酶讲解，生成荧光底物，活细胞会发绿色荧光,细胞膜表面标记 淋巴细胞亚群/活化分析 血小板分析 造血干细胞检测 肿瘤细胞标志物检测 白血病免疫分型,细胞内标记 细胞内细胞因子,细胞内标记 基因编码蛋白,细胞内标记 磷酸化蛋白： 接收刺激后细胞的动态反应 刺激因子对特异位点的作用 检测转录后调