蛋白质的定量分析：BCA法

1、,蛋白质定量分析：BCA法,实验二,主要内容,一.实验目的 二.实验原理 三.实验操作 四.注意事项 五.蛋白质定量分析方法,一.实验目的,1、学习BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作； 2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度； 3、了解蛋白质含量测定的多种方法。,二.实验原理,OH-,+2BCA,螯合物（紫蓝色）,562nm,A值,标准曲线法,M待测,蛋白质,+ Cu2+,Cu+,C待测,？,二.实验原理,562nm,A待测,含量（ug）,A,M待测,BCA法测定蛋白质含量的标准曲线,仪器型号:722型分光光度计 作图人:徐先林 时间:2

2、012年9月11日,三.实验操作,实验材料 1、器材 722型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管 2、试剂 （1）试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒 石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体 混合后调pH至11.25。 （2）试剂B：4%硫酸铜。 （3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2mL，混合。 （4）蛋白质标准液：0.3mg/mL的蛋白质标准液。 （5）待测样品。,表1 BCA法测定蛋白质含量,数据有改动,将上述各管混匀后于37C保温30分钟，用562nm 波长比色测定吸光度值。,空白管？ 1-5号管？,？,水浴锅,1、以牛血清蛋白质含量为横

3、坐标，光吸收值为纵坐 标，绘制标准曲线。（有兴趣的同学可以学习excel中绘制标准曲线） 2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量M,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。,？,实验结果记录,测定三次求平均值,四.注意事项,1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等 6、实验原始记录书写规范，三线表,一,五.蛋白质定量分析方法,BCA法,二,Folin-酚试剂法,三,紫外线（UV）吸收法,四,五,

4、考马斯亮蓝结合法,凯氏定氮法,六,双缩脲法,蛋白质元素组成特点,紫外吸收特性,呈色反应,BCA法广泛用于科研工作，其特点： 1、操作简便，快速 2、准确灵敏，试剂稳定性好 3、经济适用 4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响,思考,1、该实验设计及实验操作过程中，有没有可改进的方法，如果有请说出你的想法？ 2、比较各种蛋白质定量分析方法的优缺点，并思考各种方法的适用条件。,下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 预习要点： 1、复习蛋白质两性解离。 2、预习电泳的基本原理。 3、预习实验操作流程及注意事项。,谢谢！,一、蛋白质的相关理论知识,16%,蛋白质的平均

5、含氮量,样品中蛋白质的含量=样品中氮含量 16%（或6.25）,凯氏定氮法,1、元素组成（主要有C、H、O、N、S ）,将蛋白质转化为氨，用酸吸收后滴定,2、蛋白质的紫外吸收,280nm,紫外线吸收法,共轭双键,3、蛋白质的呈色反应,双缩脲法,Lowry法,考马斯亮蓝结合法,茚三酮反应 氨基酸与茚三酮共热，氨基酸被氧化脱氨、脱羧，茚三酮被还原，其还原物可与氨结合，再与另一分子的茚三酮缩合成蓝色的化合物，在570nm处有最大吸收。,双缩脲反应 肽键 +CuSO4紫、红色（540nm）,Folin-酚试剂反应（650nm）,考马斯亮蓝结合反应（595nm）,OH-,BCA法,BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸）,实验报告,每个大组一份完整的实验报告 名称 组员 【实验目的】 【实验试剂