DNA提取常见问题 check

1、DNA提取和常见问题 分析及对策,主讲人： 关锰,DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。,DNA简单介绍,DNA提取原则,保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,DNA提取的几种方法,CTAB法 SDS法 其它,一、染色体DNA的提取,质粒DNA的提取,线粒体、叶绿体DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,碱裂解法 煮沸法,二、非染色体DNA的提取,DNA提取的几种方法,

2、CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB法流程图,CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2

3、+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。,CTAB中各个组分的作用,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB提取缓冲液的改进配方,氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机 相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程 中出现的气泡）。 使用变性剂变性 （SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理

4、,除蛋白质：,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。,除多糖：,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,除酚类物质：,除盐离子：,70的乙醇洗涤,TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,TE中成分的作用,称取样品，液氮研磨，加入预

5、热的(65 ) CTAB及-巯基乙醇,保温1h,期间不停的摇均,吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀,10000rpm,10min,取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀, 10000rpm,10min,取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀,10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干,用TE溶解DNA,然后低温保存,材料准备： 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。 液氮研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来

6、的降解。此外尽量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。 细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。高温温浴时，定时轻柔振荡。,应注意的问题,DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙 醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。 DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。 DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。,应注意的问题,基因组DNA的检测,高质量的基因组DNA带型 单一无拖尾现象 DNA浓度及纯度的检测 A260=1 约 50 g/ m

7、L 双链 DNA， A260/280 约为1.8,DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子 有RNA的存留,原因,对 策,重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次） 加入RNase降解RNA,DNA提取常见问题,问题二：DNA降解。,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,原 因,对 策,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻