第17章 免疫学实验技术 20171218

1、第17章 免疫学试验技术,第一节 血清学试验 第二节 免疫标记技术,第一节 血清学实验,在体外鉴别抗原与抗体的试验通常有四个：凝集、沉淀、补体参与的反应、中和反应等. 因为这四种基本反应一般皆需要血清,所以体外的抗原、抗体反应又常常被称为血清学反应。(serological reaction) 一.血清学试验的类型 二.血清学试验的一般特点 三.血清学试验的优越性 四.血清学试验的发展趋向,一.血清学试验的类型,经典的血清学反应：,1.凝集反应 (agglutination),细菌和红细胞等颗粒性抗原，当与相应抗体特异结合后，在适量电解质存在的条件下，可逐渐聚集，出现肉眼可见的凝集现象称为凝集

2、反应。 反应中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素. 凝集反应是经典的血清学反应，使用历史悠久并一直沿用至今。 1896年， Widal诊断伤寒病； 1900年，Landsteriner发现人类血型并于1930年获得了诺贝尔奖金。,1)直接凝集反应（以玻片法为例）,颗粒性抗原(细菌,红细胞等)直接与相应的抗体结合,在有电解质存在的等一定条件下出现肉眼可见的凝集团块,称为直接凝集反应. 可以分为玻片法与试管法.,2)间接凝集反应,将可溶性抗原(抗体)吸附于适应的载体,在一定的环境中与相应的抗体(抗原)发生反应生成肉眼可见的凝集物.,可溶性抗原,存在于宿主组织或体液中游离的抗原物质。 可溶性抗原虽然是

3、在机体感染过程中于细胞内产生的，但是在病毒粒子的组分中有时也包含它。 它们可能是寄生虫的代谢产物；或死亡虫体释放的体内物质；或由于寄生生活所改变的宿主物质。,2.中和反应(neutralization),细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应。 中和试验是免疫学和病毒学中常用的一种抗原抗体反应试验方法，用以测定抗体、中和病毒感染性或细菌毒素的生物学效应。 凡能与病毒结合，使其失去感染力的抗体又称中和抗体。 能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体称为抗毒素。,中和试验可以在敏感动物体内(包括鸡胚)，体外组织(细胞)培养或试管内进行。 观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒

4、的细胞病变效应或中和毒素对细胞的毒性作用；以及测定抗体的其他生物学效应。,中和作用,3.补体结合反应,抗原抗体结合后激活补体所致的补体结合反应(complement fixation reaction) 原理: 补体的作用无特异性，能与任何一种Ag-Ab复合物结合； 但当Ag与Ab不相对应时，补体则不被结合而游离存在。 此时如在上述反应系统中加入绵羊红细胞(Ag)和溶血素(Ab)系统，即可与游离的补体结合而出现溶血现象。 因此，根据溶血现象是否产生，即可得知检测系统中有无相应的抗原或抗体存在。,补体结合反应,检测病毒,溶血,+,4.沉淀反应 (precipitation),沉淀反应是指可溶性抗

5、原（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。 反应中的抗原称为沉淀原，可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素。 在操作时，一般要稀释抗原。,经典方法 现代方法,环状沉淀反应 絮状沉淀反应,单向琼脂扩散法 双向琼脂扩散法 对流免疫电泳法 火箭电泳法 双向免疫电泳法,沉淀反应的主要方法,免疫扩散 （immunodiffusion）,一种抗原或抗体混合物成分的定性与定量的分析方法。 通常采用凝胶作为支持介质，让抗原与抗体混合物在介质中互相扩散，相互反应形成沉淀弧线或沉淀弧带。,二.血清学试验的一般特点,1.特异性与交

6、叉反应性 2.可逆性：表面的结合，有可逆性 3.定比性：比例合适，反应才可见，带现象。 4.阶段性：不可见-可见反应 5.条件依赖性：pH6-8），温度（37-42），电解质,网格学说（lattice theory）,抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,三.血清学试验的优越性,1、特异性强，敏感性高 2、检样量少，预处理简单 3、试验方法多，功能各异，可择优选用 4、方法简易快速 5、可用于抗原或抗体的定位,四.血清学试验的发展趋向,1、试验的微量化和自动化 2、试剂的标准化和商品化 3、方法的快速简易和标准化 4、试验的敏感、特异和精密化 5、试剂盒的系列化,第二节 免疫标记技术,一、概念

7、,将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上； 通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。,二、主要的免疫标记物,类别 标记物 用途 荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定 放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I 酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定 化学发光物 Luminol、lucigenin 免疫分析测定 金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,三、免疫标记技术的分类,按测定用途分类： 免疫组化技术：用于组织切片或其他标本中Ag或Ab的定位。 免疫

8、测定技术：用于液体标本中Ag或Ab的测定。 按标记物分类： 酶免疫技术; 荧光免疫技术; 放射免疫技术; 发光免疫技术; 金免疫技术。,四、免疫酶技术,将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。 酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体抗原反应的特异性，也不影响酶活性，即在相应而合适的作用底物参与下，表现为呈色反应。 呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的抗体抗原反应。 这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。,免疫酶技术分为两类： 免疫酶组织化学法或免疫酶染色法 免疫酶测定法： 固相免疫酶测定法 酶

9、联免疫吸附试验（ELISA） 应用最广泛,1.酶联免疫吸附试验（ELISA）,免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 ELISA过程： 抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）； 生成抗原（抗体）待测抗体（抗原）酶标记抗体的复合物； 再与该酶的底物反应生成有色产物。 借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。,基本原理,抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯（包被材料）表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶

10、结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。,抗体的免疫原性,马血清制备的破伤风毒素,一抗和二抗,一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。 二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。 当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。,1）间接法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合； 经过

11、洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,2）ELISA竟争法,五、免疫荧光（Immunofluorescence）,是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 分直接法、夹心法、间接法和补体法,免疫荧光,常用的荧光素主要有： 异硫氰酸荧光素 (FITC) ，最大吸收光谱为 490495nm ，最大发射光谱为 520530nm ，呈黄绿色荧光。 四乙基罗丹明 (RB200) ，最大吸收光谱为 570nm ，最大发射光谱为 595600nm ，呈明亮橙色荧光。 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) ，最大吸收光谱为 550nm ，最大发射光谱为 620nm ，呈橙红色荧光。,六、放射免疫测定 (RIA),将同位分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性