病毒的血凝及血凝抑制试验

1、病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 目的要求掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50mL定量移液器，滴头，微型振荡器。2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。3. 新城疫病毒液（尿囊

2、液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法（一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50mL生理盐水。2. 于左侧第1孔加50mL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50mL；第12孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50mL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2

3、048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.5%红细胞505050505050505050505050弃50结果观察+- 4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即

4、1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。(二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理盐水。3. 第孔加被检鸡血清50mL，吹吸混合均匀，吸50mL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50mL，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫阳性血清50mL，作为血清对照。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。5. 自第l孔至12孔各加0.

5、5% 鸡红细胞悬液50mL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照血清对照生理盐水5050505050505050505050被检鸡血清50505050505050505050504单位病毒505050505050505050505050室温中静置 10 min0.5%红细胞505050505050505050505050弃去50 结果观察-+-6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞10

6、0%凝集（+），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。附 录1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O） 0.80g枸橼酸（H2O） 0.055g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42g双蒸水 加至 100 ml 将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115灭菌10min,4保存备用。2. 0.5% 鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的15)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据