酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体方法的建立ppt课件

1、。1。2015年11月9日，郑思涵杨芳芳李金泽郑心宁建立伤寒O抗体酶联免疫吸附试验。2，1。什么是伤寒？伤寒是由伤寒杆菌引起的一种急性肠道传染病。伤寒是一种古老的传染病，但它在传染病的预防和治疗中仍然发挥着重要作用。中医书刊中的“伤寒”是指许多与热有关的疾病，属于中医“湿热”疾病范畴，与现代医学中的伤寒、副伤寒有不同的含义。伤寒是一种全身性疾病，不限于肠道损伤。伤寒的基本病理特征是持续菌血症和毒血症，即单核吞噬细胞系统的增殖反应，特别是下回肠的增生、肿胀、坏死和溃疡形成。伤寒的检测伤寒是由伤寒杆菌引起的一种急性传染病，可全年发生，尤其在夏季和秋季。沙门氏菌的快速检测、传染源的早期检测和传播途径

2、的阻断是预防和治疗沙门氏菌病的最有效手段。长期以来，伤寒的实验室诊断方法主要依靠细菌培养和傅克反应。前者的阳性率受抗生素应用的影响，而后者在病程的后期呈阳性，其敏感性较低。这两种检测方法繁琐耗时，难以达到早期快速诊断的目的。为了寻找一种灵敏、特异的鼠伤寒沙门氏菌抗体检测方法，我们建立了一种检测伤寒患者血清中O抗体的酶联免疫吸附试验。我们用购买的鼠伤寒沙门氏菌O抗原免疫家兔，提取兔血，经分离和粗纯化后得到粗纯化的鼠伤寒沙门氏菌O抗体。实验原理酶联免疫吸附试验是基于抗原或抗体的固相和抗原或抗体的酶标记。结合到固体载体表面的抗原或抗体仍然保持其免疫活性，而用酶标记的抗原或抗体保持其免疫活性和酶活性。

3、在测定中，样品与固体载体表面的抗原或抗体反应。在固体载体上形成的抗原-抗体复合物通过洗涤与液体中的其它物质分离。然后，加入酶标记的抗原或抗体，其也通过反应结合在固相载体上。此时，固相上酶的量与样品中被测物质的量成一定比例。加入酶反应底物后，底物被酶催化变成有色产物，产物的量与样品中被测物质的量直接相关，因此可以根据颜色深浅进行定性或定量分析。由于酶的高催化效率，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法高度灵敏。竞争酶联免疫吸附试验可以同时测定抗原和抗体。以被测抗原为例，被测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体的结合，因此酶标抗原与致因相结合的量与被测抗原的量成反比。操作步骤如下：将特异性抗体与固体载体连接

4、，形成固体抗体，清洗后密封；将注射样品和一定量的酶标记抗原的混合溶液加入待测管中，使其与致病抗体反应。如果样品中没有抗原，酶标记的抗原可以成功地与固体抗体结合。这样，收集的样品中抗原的量越高，酶标记的抗原和固相抗体之间的结合量越少，因为这些抗原和固相抗体之间存在结合。只有酶标记的抗原被添加到参考管中。孵育后，酶抗原和固体抗体的结合可达到最大量并洗涤。添加和遮蔽的颜色发展。参比管颜色最深，因为结合的酶标记抗原数量最多。参考声音的颜色深度和待测试管的颜色深度之间的差异代表待测毛巾中的抗原量。待测试管的颜色越浅，样本中的抗原就越多。7，8，9、酶联免疫吸附试验为取10个干净的试管，编号，用1:10稀

5、释血清。混合后，在37孵育24小时，观察结果。、放弃、13，3。分离和纯化抗体，取分离的免疫血清(5ml)并加入生理盐水(5ml)。缓慢摇匀，加入两种饱和硫酸铵溶液(10毫升)，室温下静置1.5小时，以2000转/分钟离心20分钟，吸取上清液。将沉淀物用适量生理盐水(12毫升)溶解，放入透析袋中，透析24小时。收集、标记并冷冻获得的伤寒沙门氏菌粗抗体。酶标抗体的制备用高碘酸钠法，将5毫克辣根过氧化物酶溶于0.5毫升PH5.6的醋酸-醋酸缓冲液中，滴加0.25毫升硫酸氢钠水溶液，混合均匀，作用30分钟。然后加入0.5毫升2.5%乙二醇水溶液，并在室温下放置30分钟。然后加入1 . 52 . 0毫

6、升待分离纯化的粗抗体，用含PH9.5的碳酸盐缓冲溶液将反应溶液的酸碱度调至约9.0，并过夜4小时。加入0.1毫升硼氢化钠溶液，混合均匀，反应2小时，溶解并沉淀在透析袋中的磷酸盐缓冲溶液中，并保持过夜。第二天收集。5.酶联免疫吸附试验前，包被抗原：伤寒抗原用包被液稀释，每孔加0.1毫升，37小时(或4小时24小时)。清洗：将孔中的液体丢弃，用洗涤液清洗3次，每次30秒，并彻底拍打在吸水纸上。加入样品：加入0.1毫升酶标抗体和待测抗体，每孔稀释倍数，混合均匀，在37培养箱中培养30分钟。清洗：将孔中的液体丢弃，用洗涤液清洗3次，每次30秒，并彻底拍打在吸水纸上。加入底物溶液：每孔加入1滴底物溶液a

7、和1滴底物溶液b，避光515分钟观察颜色变化。嘿。16，待测抗体，酶标抗体，酶联免疫吸附试验前实验，17，6，酶联免疫吸附正式实验，包被抗原。将包被液丢弃在酶联免疫吸附板孔中，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，并在滤纸上拍干。每孔加入0.1毫升工作浓度的血清和酶标抗体，同时设置阴性对照，37孵育30分钟。丢弃孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次30秒，并在滤纸上拍干。加入底物显色，每孔加入1滴底物溶液A和1滴底物溶液B，避光515分钟，观察颜色变化。嘿。18，Ab待测，酶联免疫吸附试验正式实验，19、检测伤寒O抗体的酶联免疫吸附试验，实验结果，20，1，直接凝集实验结果、2，1 2。酶标抗体的制备和鉴

8、定。用酶联免疫吸附竞争法鉴定高碘酸钠制备的酶标抗体。结果表明，阴阳最明显的色差在第三排，即最佳工作浓度为1:100，待测抗体的原始浓度与第五孔的颜色差异最大。1:25、1:50、1:100、1:200、1:1、1:5、1:25、1:125为负值。22，3。酶联免疫吸附竞争法的视觉结果，酶联免疫吸附竞争法的视觉实验结果：阴性对照孔呈蓝色；各组与阴性对照组对比明显，抗体制备良好。第二组颜色最浅，抗体效价最高。因为在第三组中没有血清要检测，所以在第三组中没有结果。1 2 4控制，4 2 1，23、用酶联免疫吸附试验检测伤寒O抗体，实验讨论和分析，24，1。在酶联免疫吸附试验过程中的注意事项，在试验前

9、半小时从冰箱中取出试剂盒，并将其平衡至室温。选择一个准确的移液器，恒温培养前的摇动过程不可忽视。操作过程应准确，实验中稀释液、酶标准溶液、质控品、阳性和阴性质控品及标本的添加量必须准确，以防止阳性质控品和未知阳性标本的飞溅造成假阳性结果，感染操作人员。孵育温度和时间是夹心抗体(或抗原)形成和竞争性结合反应的必要因素，因此应严格控制。一般来说，抗原抗体结合的时间可以缩短洗涤板是酶联免疫检测的重要组成部分，应严格按照说明书进行，以满足洗涤次数和间隔时间的要求，从而保证结果的准确性。酶联免疫吸附试验中的颜色问题，所有的检测孔都是无色的：原因可能是酶偶联物或底物的失败，底物的缺失或错误添加，阳性对照的

10、缺失或错误添加，其中酶偶联物的失败和底物的错误添加较为常见。找出原因的方法是直接将酶偶联物与底物混合，观察是否有显色；如果显色，则表明是由于阳性对照的遗漏或底物的错误添加造成的；如果它不显色，将新的酶缀合物与底物混合，观察它是否显色；没有显色表明底物无效，而显色表明原始酶缀合物无效。所有检测孔都显色：原因是洗涤板不干净(未结合的酶结合物留在孔中)或显色时间太长。酶联免疫吸附试验和傅克反应在伤寒诊断中的对比分析。伤寒的傅克氏诊断法是一种经典的血清学试验，主要检测血清中的抗体。从感染到血液产生抗体需要一定的时间，而且操作繁琐，结果缓慢(通宵观察)。鼠伤寒沙门氏菌抗原酶联免疫吸附试验，其包被的和酶标

11、记的抗体针对鼠伤寒沙门氏菌的单克隆抗体，具有高度特异性，快速和易于操作，从添加样品到解释实验结果仅需45分钟。两种方法经2次检验有显著性差异(P0.05)，可作为伤寒早期快速辅助诊断的血清学方法。近年来，使用：抗生素和皮质类固醇可抑制抗体滴度。一些病人感染较少，产生的抗体也较少。病人的弱免疫反应很弱，而且缺乏丙种球蛋白不能产生抗体。少数患者封建凝集效价不高，封建反应阳性反应出现较晚。单纯用傅克反应诊断伤寒有其局限性，而且容易漏诊。因此，用单克隆抗体早期检测血清抗原有助于伤寒的早期临床诊断。获得高滴度伤寒O抗体的原因分析在抗体制备过程中，免疫动物的选择和有效免疫程序的设计都会影响制备抗体的质量。

12、本实验采用伤寒沙门氏菌O抗原，通过耳缘静脉注射和背部皮内注射免疫健康家兔，制备伤寒沙门氏菌O抗体。与单只兔子相比，免疫兔子具有更强的免疫功能，产生更多的抗体。兔子是否每次都用抗原免疫也是实验成功的关键。获得高滴度的抗体也与足够的伤寒沙门氏菌细菌抗原和成功的注射有关。抗原直接进入血液，被免疫细胞包裹并缓慢释放，有利于持续刺激免疫系统。但是，在免疫过程中应注意控制抗原浓度和剂量，以免因抗原浓度过高和抗原剂量过高而导致家兔死亡，而过低的抗原剂量不足以刺激机体产生特异性免疫反应。所用伤寒O抗原的纯度良好。在医学研究和临床诊断中，酶联免疫技术被广泛用于检测与传染病相关的致病因素及其相应的抗体、体液中的其他抗原成分、激素和药物。酶联免疫吸附试验商业试剂检测项目可分为以下几类。病原体及其抗体的检测。病毒性感染，如肝炎病毒、巨细胞病毒