DNA芯片原理、分类与操作（.ppt

1、DNA芯片,DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（gene chips）、DNA阵列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）等。,DNA芯片技术,DNA芯片原理及分类,DNA芯片的操作,DNA芯片技术的应用与展望,基因芯

2、片的原理是基于核酸分子碱基之间(A-T/C-G互补配对的原理,利用分子生物学、基因组学、信息技术、微电子、精密机械和光电子等技术将基因或DNA分子排列在特定固体物表面构成的微点阵。然后将标记的样品分子与微点阵上的DNA杂交,以实现多达数万个分子之间的杂交反应,高通量大规模地分析检测样品中多个基因地表达状况或者特定基因(DNA)分子的是否存在的目的 基因芯片的优点： 高通量大规模高度平行性快速高效高灵敏度高度自动化 缺点：在同一温度下杂交，不同探针杂交效率不同。,DNA芯片,制备原理,原理 - 通过杂交检测信息,一组寡核苷酸探针,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,AT

3、ACGTTAGATC,TACGTTAG,由杂交位置确定的一组,核酸探针序列,GTTAGATC,杂交探针组,TATGCAATCTAG,重组的互补序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,DNA芯片,根据DNA芯片的制备方式可以将其分为两大类： 原位合成芯片 synthetic genechips:指采用显微光蚀刻技术在芯片的特定部位合成寡核苷酸而制成的芯片。 特点：合成的寡核苷酸链较短，密度较高。 DNA 微集阵列 DNA microarry:指将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面。 特点：片

4、段较长，密度较低。,DNA芯片,DNA芯片的操作及应用,DNA芯片,基因芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,DNA芯片,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦显微镜,获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,DNA芯片,芯片的制备包括 支持物的预处理、 原位合成芯片的准备 DNA微集陈列的制备,DNA芯片,基因芯片结构示意图,DNA芯片的制备,支持物分两类 实性材料 包括硅芯片，玻璃，瓷片等。目前最常用者为玻璃。预处理的目的是使其表面形成羟基，氨基等活性基团，以便与单核苷酸或DNA形成共价键 膜性材料 包括聚丙烯膜，尼龙膜，

5、硝酸纤维素膜等 通常要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷，以吸附DNA,支持物的预处理:,DNA芯片,DNA芯片的制备,原位合成芯片的制备,1 显微光蚀刻技术 优点：合成速度快，步骤少 缺点：合成的探针短，效率低 2 压电打印法 合成的探针可达40-50 nt，合成效率较高,DNA芯片,DNA微阵列的制备,采用事先合成的DNA或制备基因探针，然后打印在支持物上 喷墨打印 优点：速度快，量准，对支持物表面要求低； 缺点：斑点大，探针密度低，液滴分配不均 针式打印 优点：简便，价低，液滴小，探针密度大； 缺点：准确性和重现性差,DNA芯片的制备,DNA芯片,喷墨打印技术,DNA芯片,针式打

6、印法（接触式点样）,Best!,DNA芯片,点阵的制作,DNA芯片,样品的准备包括 样品的分离纯化 扩增 标记,DNA芯片,分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方法分离并纯化DNA或RNA（特别是mRNA）。只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作的正确。 目前分离纯化使用的试剂均有商品出售，品牌繁多，原理也不尽相同，产物收率和耗时也相差甚远,分离纯化,DNA芯片,样品准备,样品准备,样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的样品量。现已发展出固相PCR系统。 样品的标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素，或放射性核标记。标记的方式采用PCR或RT-PCR。常用的荧光色素为Cy3、Cy5。用Cy3

7、、Cy5标记dNTP，经PCR后，产物即可被标记。待测样品和对照可采用双色荧光标记。,样品扩增和标记,DNA芯片,芯片的杂交： 将已知序列的DNA探针显微固化于支持物表面，将已标记好的样品与之进行杂交，杂交过程一般在30分钟完成。样品与DNA芯片上的探针阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成 可同时平行检测许多基因序列 影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构,DNA芯片,原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除去； 样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性高，产生的荧光信号强，不完全配对的，

8、荧光信号弱；不能杂交不产生荧光信号 分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信号（位置、强度、颜色），并与对照比较，经相关软件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。 经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较，归纳，才能得出明晰的结论。,DNA芯片,DNA芯片,基因芯片扫描结果,不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫,DNA芯片,DNA芯片技术的应用,2,3,1,疾病的诊断与治疗,杂交测序,基因表达分析,DNA芯片,人类基因组编码大约30,000个不同的基因，仅掌握基因序列信息资料，要理解其基因功能是远远不够的。 因此，具有监测大量mRNA的实验工

9、具很重要。基因芯片技术可清楚地直接快速地检测出以1:300,000水平出现的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因。,DNA芯片,芯片技术中杂交测序(sequencing by hybridization，SBH)技术是一种新的高效快速测序方法。 用含65,536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200bp长DNA序列。采用67,108,864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。,DNA芯片,基因芯片在感染性疾病、遗传性疾病和肿

10、瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比： 它可以在一张芯片同时对多个病人进行多种疾病的检测； 无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小； 能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型； 极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利于大规模推广应用。 这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。,DNA芯片,DNA芯片展望,DNA芯片的出现和应用，为DNA测序，诊断，大面积人群的筛查带来了极大的方便，具有通量高，快速，等优点。但其不足之处亦是显而易见的：稳定性较低；只能探查已知基因；费用过高及临床使用的非必须性等因素成为其发展受到影响。,尽管基因芯片技术在生命科学领域越来越受到广泛的关注和重视，但在其研究与开发中目前还面临很多困难