QPCR技术细节

1、,细节决定成败 QPCR的技术细节对实验结果的影响,内容概要,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析,与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,荧光定量PCR原理,扩增曲线 荧光阈值 Ct值,荧光定量PCR原理,在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物一模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加

2、减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。 多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。,PCR产物的积累规律,PCR产物的积累规律示意图,荧光定量PCR定量原理,扩增曲线,荧光定量PCR定量原理,为什么终点定量不准确呢？,荧光定量PCR定量原理,尽管终点产物的量不恒定，但人们发现Ct（cycle threshold）与模板起始浓度有密切联系。,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号

3、达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Cycle（循环数）,Rn（荧光强度）,Ct value,荧光定量PCR原理Ct值,前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline） 荧光阈值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动设置：大于荧光背景值和阴性对照的荧光最高值；进入指数期的最初阶段 真正的信号:荧光信号超过阈值,荧光定量PCR原理荧光阈值,定量PCR的数学原理,定量PCR的数学原理,定量PCR的数学原理,定量PCR的数学原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,No

4、Template Control(NTC)确认,PCR扩增效率（E）:0.9-1.1,35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增,35 Cycles内无引物二聚体产生,相关系数（r2）：大于0.98,荧光定量PCR反应性的确认,内容概要,非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe,常用荧光标记方法,SYBR Green I染料法原理,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBR Green I,热 变 性,引物退火,延伸反应,SYBR G

5、reen I染料法作用机理,问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生， 也将 同时被检测到，从而可能导致检测结果不准确。,SYBR Green I染料法问题点与关键点,关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！,将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT),原始图谱,对数图谱,SYBR Green I染料法融解曲线,SYBR Green I染料法融解曲线,对DNA模板没有选择性 使用方便，不必设计复杂探针 具有价格优势,优 点,容易产生假阳性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量,缺 点,SYBR Green I染

6、料法优缺点,Taqman探针法原理,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,Taqman探针法工作机理,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高），也可通过温度梯度优化退火温度

7、 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,Taqman探针法PCR体系的建立,Taqman探针法荧光标记物的选择,高度特异性 重复性好 可进行多重定量,优 点,只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针,缺 点,Taqman探针法优缺点,不同定量方法的比较,SYBR法实验流程及注意事项,样品制备,模板准备,引物设计,反应条件优化,浓度确定,技能要求,环境要求,误差控制,数据分析,仪器软件,RT,上机,反应体系优化,试剂选择,分析方法,样品制备,环境要求,模板准备,数据分

8、析,RT,上机,浓度确定,SYBR法实验流程及注意事项,RT,反应体系优化,试剂选择,样品制备,模板准备,数据分析,上机,SYBR法实验流程及注意事项,模板准备,引物设计,浓度确定,环境要求,误差控制,RT,样品制备,数据分析,上机,反应体系优化,上机,反应条件优化,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,标准品,待测样本,阳性对照,阴性对照,技能要求,误差控制,上机,试剂选择,RT,样品制备,模板准备,数据分析,SYBR法实验流程及注意事项,溶解曲线,扩增曲线,1. 95oC for 15 min 2. 94oC for 10 sec 3. Gradient fro

9、m 45oC to 65oC for 15 sec 4. 72oC for 30 sec 5. 83oC for 1 sec 6. Plate Read 7. Go to line 2 39 more times 8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.,Real-time PCR体系优化,误差分析及操作规范,同一cDNA样品的三个重复,误差分析及操作规范,如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二

10、聚体引起的误差非常严重。,1. 模板浓度越低，染料法的误差越大,误差分析及操作规范,2. 某一孔荧光信号特别强,原因： 试剂配制时反应液没完全溶化，导致探针量在一管中增多； 试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同； 也可能是PCR仪热槽被荧光物质污染，这时就要清除热槽中的污染；,3.样品浓度跨度过大,样品浓度过高，至阳性样品扩增曲线在后面循环中呈一向下的直线，,误差分析及操作规范,4. 部分样本扩增效率过低,原因： 提取液残留，一定程度抑制了PCR反应； 反应液未严格取量混匀或分装不均匀；试剂失效；,误差分析及操作规范,5. 阴性对照或空白对照翘尾,原因：模板提取环境有污染；模板提取操作

11、有污染；试剂配制过程存在污染；,误差分析及操作规范,6. 直线型扩增曲线,原因：探针部分降解（探针降解原因：a.探针反复冻融稀释的探针可在4保存至少3个月，应避免反复冻融；b.探针在光线下暴露时间太长）；反应液中有PCR抑制物；,误差分析及操作规范,7.山坡形曲线,原因：常因反应管封口不严，至反应液蒸发所致。,误差分析及操作规范,8.扩增曲线断裂,原因：基线选取范围不对，基线终点大于Ct值，这通常是由于模板DNA浓度过高所致， 因Ct值15，而基线范围仍取315，其中包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值过高，解决办法：减少基线终点至Ct值前4个循环，重新分析数据,误差分析及操作规范,9.基线

12、下滑,原因：基线选取范围不对，可试着将基线范围改大一些，这一问题常因试剂质量所致；,误差分析及操作规范,10.没有扩增曲线,原因：PCR参数设置错误，在设计循环参数时将荧光信号读取时间设在反应的第一步，即stage 1阶段；电脑设定了自动休眠；,误差分析及操作规范,11. 扩增曲线有一向上或向下的尖峰,原因： 反应过程中电压不稳定；可能在20循环左右仪器有停下或者仪器有开盖，使得光线突然增强； 如果尖峰向下，也可能是卤素灯老化所致，这时应更换；,误差分析及操作规范,数据分析,软件系统,分析方法,上机,RT,样品制备,模板准备,相对定量：2Ct法 绝对定量：标准曲线法,可靠，准确的数据,SYBR

13、法实验流程及注意事项,内容概要,绝对定量解析方法,绝对定量的定义,Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,质粒标准品的制备,拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量61014,倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv

14、+9v稀释缓冲液，得标准品v,质粒标准品稀释方法与拷贝数计算,方 法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测 试 剂：DBI公司SYBR realtime PCR试剂 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取RNA并反转录； 设计特异引物； 荧光定量扩增； 结果分析：获取样品中目的基因的精确copy数。,绝对定量实验例,实验数据,绝对定量实验例,扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 1 =10-1/-3.17 1 =2.031 1.03,标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线,y = -3.1

15、7x + 37.52 R2 = 0.9988,绝对定量实验例,相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.1, 越接近1，越理想。,未知样品拷贝数的计算,将Ct值带入线性方程：,20.5= -3.1726 X + 37.52,QuantityUnknown=105.36 =229087 copies,绝对定量实验例,相对定量解析方法,相对定量的必要性,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。,管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等,筛选方法,根据文献提

16、供 通过具体实验筛选,相对定量分析管家基因筛选,双标准曲线法 2 -Ct法,相对定量分析两种常用的分析方法,通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。,相对值=,校正值=,目的基因定量结果,管家基因定量结果,待测样品的校正值,对照样品的校正值,相对定量分析双标准曲线法,公式：,优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,相对定量分析双标准曲线法,实验数据,公式：,F =,2,相对定量分析2 -Ct法,优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增

17、效率为 100 %； 假定标准曲线及每次扩增之际间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一,实验数据：,Sample,处理前,处理后,Jun(MeanCt),GAPDH(MeanCt),E,18 16,17 17.4,1.95 1.95,2 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%,Ct（处理前）18171 Ct（处理后）1617.4=1.4 Ct=Ct（处理后）Ct（处理前）1.412.4 比率（处理后/处理前）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以Jun基因在处理后表达水平比处理前高5.3倍,相对定量分析2 -Ct

18、法,发表文章,Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 in Macrophages Restrains TLR4-NF-B Signaling and Protects against Endotoxin Shock. Immunity.(2014)(影响因子：20.72) HCV-Induced miR-21 Contributes to Evasion of Host Immune System by Targeting MyD88 and IRAK1. Plos Pathog. (2013)(影响因子：9.12) Inhibition of Lysyl Oxidase Ameliorates Inflammation and Experimental Pulmonary Fibrosis.J MOL CELL BIOL.(2014)(影响因子：7.31) Exogenous Melatonin Modulates Apoptosis in t