细胞培养基本知识

1、细胞球培养的基本知识、细胞球室、准备室：进行培养器具的明确化、包装、培养物质的准备和消毒、物品的保管等。 缓冲室：为减少外部污染源进入培养室培养室：是进行细胞球培养和各种无菌操作的实验室。 其基本条件是清洁、无菌、干燥、无通风，有适当的光照。体外培养的设备和器具、超洁净台、CO2孵化机、倒置显微镜、液氮保存罐、离心分离机、水精制装置、高压蒸汽消毒装置、酶催化剂标准器过滤除菌装置、手术器械、培养器具、移液器、超洁净台、鼓风机驱动空气用高效空气微粒过滤层净化后，逐渐通过台面，操作根据气流的方向，1 .流出式、2 .侧流式、CO2孵化机、CO2孵化机的设定条件为3.7、5 CO2。 使用CO2孵化机

2、培养细胞球时应注意的问题是在使用螺旋口瓶培养细胞球时，为了确保通气而拧松瓶盖。 保持孵化机内的空气漂亮地。 定期消毒。 箱内的灭菌蒸馏水为3升，保持箱内的大气湿度，使培养液不蒸发。自动双纯水蒸馏器、培养器、一次性物品培养瓶和培养板：一般朔材培养器的细胞球生长面带负电荷，许多表面带正电荷的细胞球有利于玻璃培养瓶、溶液瓶、移液器生长，常用玻璃器皿清洗、浸渍：在5%的稀盐酸溶液中浸渍1.2时间以上，使附着在器皿表面的物质软化，器皿表面的粗糙刷洗：用柔软的毛刷将浸渍过的面用洗衣粉水反复刷洗，除去表面的杂质。 浸出酸：利用强酸化作用去除可能残留在器皿表面的有机物，时间最好在6小时以上过夜。 清洗：反复注

3、满水，将天空倒2.0次以上。 最后用二次水2.3回浸，干燥后包装。清扫液的制备、橡胶塞和塑料用品的清洗，首先用水浸泡后，用2%NaOH溶液煮沸1.0分钟，用水洗涤烘干后，再用1%稀盐酸浸泡3.0分钟，最后用水和3次水分别洗3次，烘干。 过滤除菌装置，1 .不锈钢板式过滤烟嘴：2.微孔过滤烟嘴过滤烟嘴：可更换膜式过滤烟嘴和一次性物品过滤烟嘴两种。 细胞球培养的概念是原代培养。 培养物被培养皿接种就不能分割，即使增殖也不更换容器。 包括细胞球培养、组织培养和器官培养。 继代培养：随着培养时间的延长、细胞分裂的繁殖，如果细胞球之间发生接触，接触性受到抑制，生长速度逐渐变慢或停止的话，需要将培养物分割

4、成较小的培养物。 原代培养细胞球的生命归宿、原代培养期继代培养期衰退期、体外细胞球培养物的生长类型、粘贴生长：不粘贴在支持体表面就不能生长。 在各种实体肿瘤细胞球中都可以看到。 悬浮生长：可在悬浮状态下生长，无需粘贴在支撑体表面。 在各种造血系统肿瘤细胞球中可见。 各世代贴附生长细胞球的生长过程，游离期：细胞球接种后在培养液中变为浮游状态也称为浮游期。 此时细胞质收缩，细胞呈球形。 贴壁期：细胞球附着于基质，游离期终止潜育期：此时细胞球在有生之年活动，无细胞分裂。 对数增长的长期：细胞球数随时间的变化倍增，活力最高，最适合实验研究。 停机期(平台期):细胞球充满瓶壁后，细胞球有活力但不再分裂。

5、 其反应历程：接触抑制，密度依赖性。 根据细胞球的成长依存点，传代的方法有3种。 1、悬浮生长细胞球传代离心法传代：用离心(1000 r/min )去除上清，在沉淀物中加入新的培养液后混合传代。 直接传代法：悬浮细胞球沉淀于瓶壁时，将上清培养液除去1/2/2/2/3，用吸管直接喷涂来形成细胞球混悬剂来传代。2 .半悬浮生长细胞球传代(Hela细胞球)之类的细胞球部分呈现贴壁的生长现象，但贴壁不一盏茶，可以直接用吹气法使细胞球从瓶壁脱落，进行传代。 3 .带壁生长细胞球的传代由酶催化剂消化法传代。 常用的消化液有0.25胰蛋白酶，贴壁生长细胞球传代的方法，1 .吸光培养瓶培养液，用PBS溶液洗涤

6、23次。 加入2.12ml0.25的胰蛋白酶液(以消化液复盖整个瓶底为基准)，静置2-10 min (显微镜下的动态监测)。 3 .吸入胰蛋白酶液，加入培养液。 4 .用吸管吸取瓶内培养液，反复喷涂瓶壁细胞，形成细胞球混悬剂。 1/101/40吸取4.0细胞球混悬剂，接种新的培养瓶。 6 .将适量新鲜培养液装入接种了细胞球混悬剂的新培养瓶中。 7 .将后者放入孵化机中培养。 培养细胞球的生长条件，1 .细胞球的营养2 .细胞球的生存环境温度： o2co 23360 % co2h2o3HCO3- ph :2-7.4渗透压3无污染4无毒，细胞球培养用液水：新配置的三蒸水或脱络离子水平衡盐溶液： C

7、a2， 将Mg2的缓冲液PBS:NaCl8. 00 GNA2hpo4h2o1. 56 GK h2po4. 20 g调整为1000 ml PH的ph，消化液1 .胰蛋白酶：主要使用0.25胰蛋白酶液，胰蛋白酶为黄色白色粉末，使用没有Ca2、Mg2的PBS缓冲液调制作用于赖氨酸和精氨酸，除去细胞球间粘蛋白和糖蛋白，影响细胞骨架，分离细胞球。 浓度越高，作用越强，但超过一定的限度会损伤细胞球。 用含血清的培养液停止消化作用。 2. EDTA :化学鳌合剂，对细胞球有一定的解离作用。 毒性小，价格便宜，使用方便。 3、胶原酶溶液：又称羧肽酶，有胶原酶、型和肝细胞专用胶原酶5种，根据组织细胞混悬剂的制备

8、可选择不同种类的胶原酶，培养基、培养基(培养液)是维持体外细胞球生存和生长的溶液，可分为天然培养基和合成培养基。 1 .天然培养基：有血清、血浆、组织提取液(鸡胚和牛胚液浸等)。 优点：营养成分丰富，培养效果好的缺点：来源有限，成分复杂，影响某些实验产物的提取和实验结果的分析，容易发生支原体污染。 2合成培养基：根据细胞球生存所需物质的种类和数量，以人造的的方法模拟合成。 主要成分为氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他辅助物质。 优点：标准生产，成分和含量相对固定，成本低。 缺点：部分成分不足，不能完全满足体外细胞球生长需要，需要补充一定量的天然培养基(如血清)，常用血清为：胎牛血清、新生

9、牛血清、犊牛血清、兔血清、马血清等，其中胎牛血清质量最好。 优质血清标准：透明，鹅黄色，无沉淀物，细菌，支原体，无细小病毒污染。 血清中含有多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等)的多种金属络离子； 促进荷尔蒙激素粘着蛋白质、冷析球蛋白、胶原等附着的物质。 各种生长因子转移蛋白不明成分，一般含有5犊牛血清的培养基在许多细胞球中可维持细胞球不灭，而为了支持细胞球的生长需要加入1.0血清，这被证明是支持血清生长的生物科学效果，但血清中的复杂成分尚未完全阐明。 由于血清中不仅存在细胞球生长促进因子，而且还存在细胞球生长抑制因子和毒性因子，因此在含有血清的培养基中培养的细胞球反映的生物科学特性是细胞球和

10、复杂的血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程科学、基因表达调控等研究领域，迫切需要在无血清培养基中培养细胞球，血清质量的好坏是实验成功与否的关键。 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、犊牛血情、兔血清、马血清等，其中胎牛血清质量最好。优质血清标准：透明，鹅黄色，无沉淀物，细菌，支原体，无细小病毒污染。 血清失活(补体活性消失):5.6、3.0成分血清消毒：过滤除菌、使用抗生素、培养液配制后，向培养液中适量添加抗生素，抑制可能存在的细菌生长。 通常青霉素和链霉素并用。 培养基内青霉素、链霉素的最终使用浓度为每ml 100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定、完全培养基组成，基础培

11、养基80 95血清520 HEPES，碳酸水素金属钍按培养基类型添加蓝、链霉素各100单位ml， RPMI-1640培养基的制备：在RPMI-1640培养粉1袋的碳酸水素金属钍2.2 g HEPES 2.385 g蓝、链霉素各100单位ml中加入三蒸水制成1000ml，进行过滤除菌。 将pH调节到7.2-7.4加入血清(最终浓度1.0 )，细胞球的冷冻保存和复苏、冷冻保存是将体外培养物悬浮在加入了冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降低到极低温条件，在该温度下长期保存的过程。 复苏是以一定的复温速度将冷冻保存的培养物恢复到常温的过程。 冷冻保存和复苏的原则：缓慢冷冻可使细胞球冷却至冰点，细胞器

12、脱水，细胞球中的可溶性物质浓度上升，在细胞球内形成冰晶。 如果慢慢冷冻的话，细胞球会慢慢脱水，在细胞球内不会形成大的冰晶。 大的结晶会引起胞质膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应尽快融化，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的再结晶。 慢冷冻计程仪柱，标准计程仪柱：温度在- 2.5以上，12 /min温度在- 2.5以下，510 /min温度达到-100时，迅速放入液氮的简单计程仪柱：冷冻管(口要向上)放入纱布袋，用纱布袋绑，纱布袋液氮低温保护剂的应用，可以在细胞球冷冻保存时加入温度保护剂，大幅度提高冷冻保存效果。 常用的低温保护剂为DMSO，是渗透性保护剂，可以快速渗透细胞球，提高胞质膜对水的

13、渗透性，降低冰点，延迟冻结过程，把细胞球内的水分在冻结前排出细胞球外，在细胞球外形成冰晶，减少细胞球内冰晶，减少冰晶对细胞球的损伤。 细胞球冻存方法，1 .冻存液制备：采集20%血清培养基、10% DMSO 2.对数生长细胞球，用胰酶催化剂消化后，加入适量冻存液，用吸管喷涂，将细胞球混悬剂(1106 5 106细胞球/ml)3.1ml细胞放入冻存管中，密封示冻存细胞名称和冻存日期。 4 .年后，成活率将达到8.0以上。 DMSO液用培养液配制，5 .以暂时配制的发热避免损伤细胞球。 人造血干细胞的研究证明，细胞球的恢复方法，1 .从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中使之熔化(1分钟左右)

14、。 在2. 5分钟内用培养液稀释到原来体积的1.0倍以上。 3 .低速离心1.0分。 4、去上清，加入新鲜培养液培养刚复苏的细胞球。 培养细胞球的活力测定，无论在哪个培养瓶内生长的细胞球，都由死细胞和生细胞球构成，很难在形态上区分死、生细胞球。 细胞球活力测定是肿瘤体外研究应用最广泛的技术手段之一。 1 .细胞克隆形成率实验2 .台望蓝法3 .四唑盐(MTT )比色法，1 .细胞克隆形成率实验：单个细胞球在体外增殖6代以上，形成肉眼可看见由子孙组成的细胞球群的爱沙尼亚克朗。 爱沙尼亚克朗形成死亡被用于表达细胞球的增殖能力。 爱沙尼亚克朗形成率接种细胞球多于爱沙尼亚克朗形成数的缺点：操作繁杂：精确可靠，2 .台望蓝法活细胞球未染色，死细胞染蓝色，以活细胞球在细胞中所占比例表现细胞的活力。血球计数器：手动计数细胞球，3 .四唑盐(MTT )比色法MTT称为噻唑蓝，其原理：活细胞球中的黄素脱氢酶把四唑盐还原成不溶性的水，使其在细胞球中沉淀，而死细胞没有这种功能。 二甲基亚砜(DMSO )溶解了细胞球中沉积的蓝紫色结晶物，溶液颜色的浓淡与所含的蓝紫色生成物的量成正比。 用酶标仪测定ODD值MTT的方法简单快速准确，广泛应用于新药