植物组织培养-外植体的选择与建立.ppt

1、a，1。第三节外植体(培养物)的建立。1.主要任务：在试管中成功建立外植体。2.主要技术环节：(1)、外植体的选择(2)、外植体的消毒(3)、培养基的选择和制备(4)、外植体的消毒和接种(3)、关键问题(1)、污染(2)、褐化(a、2)、第二节外。然而，目前并不容易显示出每个细胞的全能性。因此，外植体(初始培养物)的选择非常重要。A，3，1，基因型：再生能力(1)，双子叶和单子叶；(2)被子植物和裸子植物；(3)双子叶植物：茄科)；秋海棠(秋海棠科)；景天科；苦苣苔科；十字花科植物具有很强的再生能力。郁金香再生能力弱。(4)同一植株体内再生能力强，体外再生能力也强。第2节外植体(培养物)的选择

2、，A，4，杜鹃花，第2节外植体(培养物)的选择，A，5，2，根据母株的年龄和生长阶段进行选择，第2节外植体(培养物)的选择，A，6，2，根据母株的年龄和生长阶段进行选择。根据母株的年龄和生长阶段进行选择：第2部分：外植体(培养物)的选择，A，8:杜鹃花，第2部分：外植体(培养物)的选择，A，9:外植体(培养物)的选择，第2部分：A，10，3:根据时间和季节进行取样，第3部分。根据时间和季节，第二部分是外植体(培养物)的选择。一二四。具有原始结构的外植体：茎尖、侧芽、原球茎、鳞芽、分生组织和没有原始结构的外植体：根、茎、叶、花、果实等。第2部分：外植体(培养物)的选择，A，13，外植体(培养物)

3、的选择，A，14，外植体(培养物)的选择，A，15，外植体(培养物)的选择，A，16。感染能否有效控制微生物污染是植物离体培养成功的关键技术之一。对于体外培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模试管繁殖生产，污染大大增加了生产成本。因此，科研机构和制造商都非常重视微生物污染。植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境。其中，培养基污染和无菌操作得到有效控制。外植体的污染是最复杂和最难控制的，它可能是由细菌或真菌引起的；微生物可能是附着的或内源性的。近年来，国外更加重视各种微生物的鉴定，并针对不同类型的微生物采取相应的控制措施，该领域的研究进展迅速。第三部分是外植体

4、(培养物)的建立，A，20，(1)，污染因素：外植体：多年生木本材料通常比二年生草本材料携带更多的细菌；旧材料比新材料携带更多的细菌。地里的细菌比温室里的多。有土壤的材料比干净的材料携带更多的细菌。一年中，雨季细菌较多的材料和中午阳光最强的材料较少。培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用，以及滤膜的孔径、过滤灭菌设备的灭菌处理和过滤灭菌的操作，都影响培养基的灭菌效果。操作环节：接种室是否干净、干燥、密闭，是否经常用紫外线灯照射，用甲醛熏蒸，用70酒精喷雾消毒等。以及操作是否熟练。文化环境：文化室应干净、密封。每天用70度酒精喷雾灭菌和降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如果有空气过滤装置，

5、效果会更好。当培养室的相对湿度过高时，污染会加剧。第三节外植体(培养物)的建立，A，21，(2)防止污染：保护母株：保持母株清洁，减少喷灌。温室种植，喷洒杀菌剂降低病原菌含量。选材：选择生长健壮、病虫害少的材料。严格清洗、消毒和无菌操作。小容器，分散接种。第三节外植体(培养物)的建立，A，22，(3)污染估算及对策：污染估算：通常第一次接种的污染率为40.60%，按40%计算：接种100个材料，1个材料/容器：污染量=10040%=40，获得量=100-40=60。2材料/容器：2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36%污染率=10

6、0-36=62%污染量=100X62%=62获取量=1000 3材料/容器：污染率=100-(60%)3=78.4%污染量=100X78.4%=79产量=100X(60%)3此时，必须采取一些特殊措施来有效地控制真菌。材料来源：从保护条件下生长的植物中提取材料，可以有效控制微生物污染。保护条件是指温室、孵化器和生长室。从温室和恒温箱中提取材料可以有效地减少附生细菌的数量。与温室种植的植物相比，前者的污染率较低。所选植物的生长土壤是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，土壤应事先消毒。此外，灌溉用水也可能成为污染源。它取自丽水市用过滤水和饮用水灌溉的植物。前者大大减少了微生物污染。材料预

7、处理：在外植体常规化学灭菌前对特殊材料进行特殊预处理，可取得良好效果。例如，在对绒毛浓密的枇杷幼果进行杀菌之前，先将绒毛刮掉，杀菌效果非常好。对于绒毛密集的叶子，可以先用自来水冲洗枝叶，然后用0.5-20浸泡1小时(其间换23次新鲜液体)，再用常规方法消毒，这样可以起到彻底消毒的作用。兰花花蕾常规灭菌前，用10%苯扎氯铵溶液浸泡10分钟，效果非常好。第三节外植体(培养物)的建立，A，24，(5)内生细菌的控制：在植物组织培养中，材料只能在表面灭菌，但通常很难处理材料中携带的细菌。表面污染和内源污染的区别：第三节外植体(培养物)的建立，A，25。常见的内生细菌主要是芽孢杆菌，尤其是地衣芽孢杆菌和

8、枯草芽孢杆菌(“白色幽灵”)。真菌主要是镰刀菌、黄萎病菌、甲拌磷和丝核菌。内生细菌的检测：通常，通过观察培养瓶可以看到一些污染的迹象；然而，对于生长缓慢的细菌或内生菌，仅仅用肉眼观察是不够的。有必要通过指令培养使外植体上的微生物快速生长，即使用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，然后鉴定它们。将蛋白胨、胰蛋白胨或酵母汁(YE)加入培养基中。第3节外植体(培养物)的建立，第26节，第3节外植体(培养物)的建立，预防方法：向培养基中加入抗生素。使用茎尖培养。使用无菌材料。A、27、内源性细菌的抗生素控制：外植体顶芽培养中发现的污染、不同采收期外植体的污染以及表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内源性

9、细菌引起的。无论采用何种表面消毒方法，内生菌造成的污染都无法完全消除，因此必须使用抗生素进行间接预防和治疗。选择合适的抗生素尤为重要。理想的抗生素应具有以下特点：溶解性、稳定性、不受酸碱度和培养基差异的影响、无边界效应、广谱、杀菌、无耐药性诱导、廉价和对人体无害。第3节外植体(培养物)的建立，A，28，常用的抗生素有：链霉素(10毫克升)、青霉素(20毫克升)、狄拉克霉素(5毫克升)、齐墩果酸(20毫克升)、杆菌肽(50毫克升)和新霉素(1毫克升)。如氧氟沙星(氧氟沙星注射液)4080毫克升和注射用青霉素96192毫克升能有效抑制枣试管苗的细菌污染，而链霉素40800毫克升和硫酸庆大霉素206

10、0毫克升对枣细菌的抑制作用不明显。第三节外植体(培养物)的建立，A，29，单一使用一种抗生素通常效果不佳，多种抗生素的协同使用可以起到协同作用，但有时也可能使个别药物相互作用而失效。几种高浓度杀菌剂的联合使用可能对植物有害。对于特定的细菌，确定抗生素的最小杀菌剂量是非常重要的，这可以通过不同浓度的抗生素与细菌的液体共培养来确定。如果找到了有效浓度，可以在实验处理之前确定对植物材料的毒性范围。第三节外植体(培养物)的建立，A，30。抗生素对植物材料的毒性因植物类型的不同而有很大差异，因此利用植物离体培养进行基础试验是实验成功的重要一步。由于植物毒性或抗生素渗透性差，抗生素在污染处理实验中也可能无

11、法分离组织。了解抗生素对细菌和植物的影响是消除污染和保护文化的关键。此外，抗生素通常被添加到培养基中作为污染预防，或者用于抑制细菌生长或当细菌污染被确定时消灭细菌。抗生素在中性介质(pH6.57.5)中的抗菌效果远高于常规状态，但在酸性条件下无效。抗生素是热敏性的，因此不能在高温高压下灭菌，只能通过过滤灭菌添加到培养基中。第三节外植体(培养物)的建立，A，31，(6)，特殊污染源：应特别注意一种乳白色细菌污染，即芽孢杆菌。法国森林育种协会鉴定它为杆菌属，被胶囊包裹，耐高温，因此很难被普通消毒剂杀死。它可以与文化材料和器具一起传播。它可以出现在培养基的表面，或者以水滴的形式存在于培养基中。一旦发

12、生，应及时消除污染源，使用过的器具应严格高温消毒。第3节：外植体(培养物)的建立，A，32，5。褐化：(1)概念：外植体在培养容器中被氧化和褐化并死亡的现象。第三节外植体(培养物)的建立，A，33，(2)外植体材料的褐变原理：植物组织的褐变是由含铜氧化酶如多酚氧化酶和酪氨酸酶引起的，作用于它们的底物通常是酪氨酸和邻羟基酚如绿原酸。当植物正常生长时，酶和底物在组织的不同部分。当细胞受伤或组织死亡时，酶和底物一起起作用。当苯酚被氧化成活性酸化剂和环状聚合物氧化蛋白时，会形成深色化合物，这些化合物迅速被氧化并成为复杂的抑制物质，导致外植体材料的褐变和死亡以及培养基的褐变。第三节外植体(培养物)的建立

13、，A，34，(3)，褐化的可能因素：它与组织培养植物品种有关：不同植物种类和品种之间有很大的差异，有些人把这归因于基因型的差异。一般来说，植物材料中单宁和各种酚类化合物的含量较高，容易导致外植体材料的严重褐变。大多数木本植物比草本植物更容易褐变，多年生草本植物比黍更容易褐变。外植体(培养物)的建立在第三部分，A，35和外植体(培养物)的建立在第三部分与取样外植体的年龄有关：褐化程度通常与取样外植体的年龄有关，通常幼嫩部分的褐化较轻，并且褐化随着组织的老化而增加。因此，在接种外植体时，通常需要剥去鳞片和大叶子，尤其是用幼芽尖或顶芽分生组织(或少量袁烨组)接种更为理想。外植体的褐化程度通常与外植体

14、的取样时间有关。一般来说，在春季和夏季，尤其是在春季，生长旺盛部位的外植体褐变较轻，而软木或木质化枝条和休眠芽作为外植体时，褐变严重。第3、A、37节外植体(培养物)的建立和第3节外植体(培养物)的建立与培养基有关：培养基的状态(固体、半固体或液体培养基)、无机盐的浓度、激素的种类和浓度以及培养基的酸碱度都与外植体接种后的褐变程度有关。一般来说，在液体介质上添加滤纸桥和半固体介质上的褐变程度比固体介质上的要轻。外植体在低盐培养基中的褐变程度，尤其是在低浓度的Mn2和Cu2离子中，比在高盐培养基中要轻。培养基中的细胞分裂素不仅能促进酚类化合物的合成，还能刺激酚氧化酶的活性。因此，高浓度的BA会加

15、剧外植体的褐变程度。培养基的低酸碱度通常有利于减少外植体的褐变。38与温度和光照有关：外植体接种后，培养开始时的温度和光照条件往往在一定程度上影响外植体的褐变程度。第三节外植体(培养物)的建立，A，39，(4)防止褐变的几种方法：根据外植体褐变的原理及相关影响因素，可以采取以下方法来防止或减少褐变，提高外植体接种的成功率。去除方法：用流水冲洗材料：在外植体表面消毒之前，用流水冲洗材料一段时间(几个小时或一夜)，然后消毒并接种表面，接种后在短时间内(一天后)将它们转移到新鲜培养基中数次，直到褐变基本消失。多次转移：在外植体接种开始时，用液体培养基振荡培养一段时间，并在短时间内多次更换新鲜培养基，待褐变现象明显减少后，再转移到固体培养基中培养。第三节外植体(培养物)的建立，A，40，吸附法：用活性炭或聚乙烯吡咯烷酮吸附苯酚及其有害产物。一般来说，培养基中可加入23克活性炭、520克聚乙烯吡咯烷酮或两倍量的铁-乙二胺四乙酸(螯合铁)，这样可以减少褐变的危害。改变氧化还原电位法：还原剂的应用可以降低氧化还原电位，有效防止褐变。常用的还原剂包括维生素C