大肠杆菌及大肠菌群计数方法#一类特选

1、大肠杆菌和大肠杆菌群计数方法enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：检测大肠杆菌群和大肠杆菌的传统方法冷藏和冷冻食品中大肠杆菌的LST-MUG检测(双壳软体动物产品除外)矿泉水检测方法贝类和贝类肉制品试验方法柑橘果汁中大肠杆菌的检测计数大肠杆菌群和大肠杆菌数的其他方法参考文件Escherichia coli(大肠杆菌)以前常被称为大肠杆菌，1885年由德国儿科医生Theodor Escherich在人类和温血动物的肠道中广泛发现，是需要人和动物肠道中氧共生菌的有益植物，是维持宿主健康部分生理功能所需的肠道细菌。大肠杆菌是一种肠杆

2、菌，包含许多细菌，包括昆沙门胧、志贺菌和鼠疫菌。大肠杆菌大部分是郑智薰致病菌，但如果宿主免疫力差，或者细菌侵入肠道外组织或器官，就会引起非因性感染。部分血清型会产生毒素，作为致病性大肠杆菌，会引起人类腹泻。1892年，Shardinger建议使用大肠杆菌作为粪便污染的指标。大肠杆菌在人类和动物中很普遍，在其他地方很少见。此外，大肠杆菌可以使葡萄糖发酵(后来变成乳糖)，产生气体。与已知的非产气病原体很容易区分。由此，大肠杆菌检测成为水和食品最近的粪便污染指标，表明可能含有病原体。肠内柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌及肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的外形非常相似，以大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复

3、杂。因此，“大肠杆菌”(Escherichia coli)一词不是分类学的定义，而是培养35 到48h，产生酸气，革兰阴性孢子的工作定义。1914年，全国公共卫生协会把大肠杆菌群作为重要的健康标准。大肠杆菌群的检测很容易，但不一定与粪便污染有关。因为自然环境标本中也经常有。因此，粪大肠菌群成为粪污染的指标。首先，Eijkman的意思是在高温下发酵乳糖，也称为耐热大肠菌群(耐热大肠菌群)，是总大肠菌群的子集。粪便大肠杆菌群检测，水，贝类，贝类养殖水等在44.5 ，所有其他食物在45.5 进行。大便大肠杆菌群大部分包含装扮吗？Klebsiella也起到粪大肠杆菌的作用，但是Klebsiella的检

4、测被认为与粪便污染无关。因此，大肠杆菌被用作另一个重要指标。采用了快速确认大肠杆菌的新方法，检测大肠杆菌比较容易。现在在其他应用中，大肠杆菌、大肠杆菌群、粪大肠菌群等三种被用作污染指标。大肠杆菌群常用作水或食品加工中卫生状况的指标。粪便大肠杆菌组对贝类和贝类养殖数量的标准指标。大肠杆菌用于最近的粪便污染或不卫生的处理过程。几乎所有的检测方法都是使乳糖发酵。最可能的数值方法(MPN)是包括近似检查和完全验证的统计方法。在测试过程中，样品要进行一系列稀释。记录发酵乳糖气体的阳性管数，然后进行另一个两阶段实验，利用阳性结果统计表(见附录2)估算细菌数，只有前两个阶段用于大肠杆菌群及粪大肠菌群检测，第

5、三个阶段都用于大肠菌群检测。三观MPN法用于检测大多数食物，五观MPN法用于检测水、贝类和贝类食物。10管MPN方法用于检测矿泉水或估计此样品受到严重污染。另一种使用VRBA培养的固体板计数法包含中性红色，在发酵乳糖时产生红色菌落，作为指示剂。另一种膜过滤法检测大肠杆菌群及粪便大肠杆菌群等，主要是发酵乳糖生产酸，殖民地颜色形成不同。本章还介绍了大肠杆菌的荧光检测。检测贝类的特殊方法；简单的矿泉水检测方法；与HACCP规定相关的柑橘果汁中大肠杆菌的检测方法。1.检测大肠杆菌群、粪大肠杆菌群和大肠杆菌的传统方法A.设备和材料1.水浴箱：44.50.2，水浴箱中的水必须高于试管的培养基水平。2.插入

6、温度计：1-55，约55厘米，准确度0.1，必须通过NIST或相关部门测试3.培养箱：351.0c4.电子秤：减感0.1g，计量范围大于2Kg5.同质异能或同质异能病(见第1章)无菌吸管：1.0ml和10.0ml无菌产品： (用于样品处理)无菌稀释用玻璃瓶装殖民地计数器或等效产品10.长波紫外线灯：(-365纳米)不超过6瓦11.PH米B.徽章和试剂黄绿色乳糖胆结石汤，2% (M25)LST肉汤(M76)EC肉汤(M49)L-EMB琼脂(M80)胰蛋白酶(色氨酸)汤(M164)MR-VP汤(M104)鼻疽柠檬酸盐肉汤(M72)标准方法(PCA)(M124)Butterfields磷酸盐缓冲液(

7、R11)或等效稀释液(不包括贝类)“Kovacs”试剂(R38)V-P试剂(r809)革兰染色液(R32)甲基红指示剂(R44)郑秀晶紫罗兰中性胆结石琼脂(VRBA)(M174)VRBA-MUG琼脂(M175)EC-MUG徽章(M50)LST-MUG肉汤(M77)0.1%蛋白胨水稀释剂(R56)c，MPN方法-用于大肠杆菌群、粪大肠杆菌群和大肠杆菌群的计算将50g样品放在高速捣碎的杯子里，参阅第一章或目前的FDA设备。冷冻样品在2-5 解冻，但不要融化。加入450毫升磷酸盐缓冲液，搅拌2分钟，样品量低于50g，取一半样品，加入足够数量的无菌稀释剂，制作1: 10的样品液，让杯子里的液体完全复盖

8、。稀释倍数根据大将军的样品污染情况，用稀释剂使样品增加10倍，样品稀释液，以30厘米振幅在7s内摇晃25次(或用仪器振动器振动)。分别接种3管LST，每管接种1毫升，吸管末端在试管壁停留2-3s的适当3个连续稀释也确保从样品稀释液准备到稀释整个过程不会进行超过15分钟。以贝类食品和贝类养殖水5管MPN方式接种的LST管放置在35 ，对242h时在役管内生产气体的试管进行检查、记录，未燃气试管继续培养24h，对482h时生产气体情况进行检查、记录，对生产所有气体的试管进行确认试验。d，MPN法.大肠杆菌鉴定试验将所有LST肉汤生产机关接种为市黄绿色乳糖胆汁盐(BGLB)肉汤的接种环。在35 培养

9、Bgp试管482h，记录所有bgd肉汤的数量。按BGLB六水器歧管数，检查MPN表(见附录2)，计算大肠杆菌的最大值。e，MPN法-粪大肠杆菌群和大肠杆菌鉴定试验从产气LST六水管到EC六水管接种培养物1环(也可使用树木预防棒)。将接种的EC六水管全部放入复盖水浴箱，在45.5 培养242h，检查煤气生产情况。如果不生产煤气，则继续培养到482h，检查煤气生产情况。根据产气机构数确认mpf表，计算粪大肠杆菌群MPN值。继续进行Escherichia coli分析，然后按照下面的f部分执行。EC肉汤MPN方法可用于海水和贝类肉的粪大肠杆菌群检测。注：在水、贝类、贝类养殖水中，粪大肠菌群测试的培养

10、温度为44.50.2 以外的所有食品中，粪大肠菌群的培养温度为45.50.2 。f，MPN法-大肠杆菌的完全测定大肠杆菌完全测定前，轻轻弯曲气体的EC肉汤试管，李红美蓝板(L-EMB)，35 接种18-24h的器官培养培养基，在黑中心确认有金属光泽或无金属光泽的扁平集落。在PCA倾斜培养基上接种5个典型菌落，在35 培养18-24h，进行进一步检查。注意：5个可疑的殖民地中，可以检测出哪一个是大肠杆菌，以确认EC肉汤是阳性的。因此，不是所有五个殖民地都需要检查。革兰染色：革兰染色的阴性短缩细菌培养都要通过IMVIC生化反应检查和LST肉汤再接种，进行产气确认试验。吲哚试验：将PCA斜面纯培养物

11、接种到胰腺蛋白胨肉汤中，在35 培养242h，加入Kovacs试剂0.2-0.3ml。上层有明显的靛蓝基质阳性反应。VP测试：将纯培养物接种到MR-VP汤中，在35 培养482h后，用灭菌操作将培养物1ml 13*100mm试管中的0.6 MLA-萘酚溶液、0.2ml 40%KOH溶液和一些肌酸结晶。摇晃试管，静置2小时。如果出现红色，则表示VP阳性反应。甲基红测试：VP测试后试管中MR-VP培养的其余部分为35 到482h继续培养。添加5滴甲基红溶液，培养为甲基红检查阳性，黄色后出现语音反应。柠檬酸盐试验：在胆酸肉汤中接种纯培养物，防止过量接种混浊。在35 培养96h时，培养是明显的混浊是阳

12、性反应。发酵乳糖气体生产试验：在LST肉汤接种纯培养菌，35 培养482h，产气或试管轻轻摇动，气泡呈阳性产生。结果报告：所有培养材料(a)在35 到482h小时内乳糖生产气体(b)革兰氏阴性杆菌(C)IMVIC测试为-或-Escherichia coli。然后，根据EC肉汤中的阳性管数(连续3稀释度)对MPN表(见附录2)进行了调查，计算了每克(ml)样本的大肠杆菌MPN值。注：您可以使用API20E或VITEK生化分析确定大肠杆菌，而不是IMVIC生化检查。G.大肠杆菌固体培养基的测定按照制造商的指示，在结晶紫中性积淀(VRBA)冷却到48 时制造储备。样品准备是根据上述I.C部分准备的。

13、每个稀释度根据细菌受损和挤压的程度，将2个1毫升样品液分别转移到2个灭菌盘。将冷VRBA培养基添加到盘子中，小心地旋转碟子，将培养基与样品溶液充分混合。琼脂凝固后，添加5mlVRBA培养基防止细菌生长。如果细菌细胞损伤严重，通过复苏术，取冷8-10ml至48 的胰蛋白胨豆琼脂，将培养基与样品液充分混合，在室温下放置20.5h，然后放入冷8-10ml至48 的VRBA培养基，复盖平板表面。将凝固的板在35 下反向培养18-24h，检测乳制品时，在32 下培养18-24h，在有光源的放大镜下检查板。选择有25-250个群体的板，出现在板中的典型大肠杆菌群，典型群体呈紫红色，群体周围有红色胆盐沉淀环

14、，群体直径为0.5毫米以上。为了确认大肠杆菌群，从VRBA板中选择至少10个典型菌落，接种到BGLB肉汤，在35 培养24h和48h，观察产气情况。注：产气BGLB肉汤被判定为大肠杆菌群阳性。形成菌膜的阳性管要进行革兰染色，挑选革兰阳性菌。每克样本的大肠杆菌群数等于最后确定为阳性的试管百分比乘以VRBA可疑群体，再乘以稀释倍数。另一种方法：大肠杆菌与大肠杆菌群区别，每个VRBA覆盖物在琼脂上添加100ug MUG，培养后，大肠杆菌在长紫外线灯下呈现蓝色荧光。(请参阅LST-MUG第ii节)h，用膜过滤法(MF)检测大肠杆菌群：见部分iii，矿泉水检测。注意：大多数食品容易粘在胶片上，因此MF方

15、法最适合测试水样，MF方法也可以用于微量颗粒较少的液体食品。.lst-mug法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌(双壳软体动物产品除外)LST-MUG的原理是，-葡萄糖苷酶将MUG分解为4-MU，在长紫外线灯(365nm)上，MU在殖民地周围的培养基上显示蓝色荧光，从而容易区分。大肠杆菌产生-葡萄糖苷酶，包括95%以上不产生气体的几个菌株，大肠杆菌O157: H7不产生这种酶。通过-葡萄糖苷酶区分大肠杆菌和大肠杆菌O157: H7的情况很多，-葡萄糖苷酶阳性O157: H7确实存在。肠杆菌科中，除了某些志贺菌(44-58%)和昆沙门胧(20-29%)含有这种酶外，其他细菌不含这种酶。因此，从公共卫

16、生的角度通过葡萄糖苷酶检测病原体的过失并不是缺点。-葡萄糖苷酶的活性受催化抑制的影响，有些大肠杆菌是-葡萄糖苷酶阴性，甚至携带编码这种酶的Vida基因。但是研究结果显示，大约96%的大肠杆菌没有这种酶刘涛，-葡萄糖苷酶阳性。某些徽章(如EMB徽章)包含遮挡mu荧光的荧光物质，MUG几乎可以在所有徽章上添加大肠杆菌检查。在LST中添加MUG，大肠杆菌可以通过发酵乳糖气体进行检测，大肠杆菌可以通过在肠外腺光源上观察荧光，在24小时内几乎识别出大肠杆菌。LST-MUG培养基用大肠杆菌检测除贝类外的冷藏和冷冻食品。关于MUG分析，您可以咨询Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大学公园、MD、

17、20740、301-436-1650注：观察LST-MUG试管的荧光时，内燃式6w外发光灯符合黑暗处长紫外线灯(365nm)下的完美要求，且安全。使用高功率紫外线灯的情况下，15w紫外线灯的情况下，应戴防紫外线眼镜和手套。与此同时，在使用MUG方法之前，所有玻璃试管本身是否包含荧光，有时二氧化铈添加到玻璃上进行质量控制检查，在紫外线灯下产生荧光，干扰MUG检查。因此，在MUG检测中，对阳性菌株和阴性菌株进行对比是非常必要的。1、设备和材料：见上一节I.A玻璃试管：新，一次性(100*16mm)玻璃试管：新，一次性(50*9mm)长紫外线灯6w或等效。2、徽章和试剂：请参阅I.B的前面部分3、LST-MUG法近似检测大肠杆菌除了LST-MUG肉汤而不是LST肉汤外，样品制备和检测过程与前一部分I相同，应使用-葡萄糖苷酶阳性大肠杆菌(ATCC25922)和阴性肠道细菌(ATCC13048)作为对照。在35 下培养24 482h，检查气体和浑浊的试管，在长紫外线灯(365纳米)下观察荧光，并假定蓝色荧光是大肠杆菌阳性。莫伯格研究表明，使用荧光方法，24小时大肠杆菌为83-95%，48h后判定准确度为96-100%。