第三章 固定化生物催化剂反应过程动力学.ppt

1、第三章固定化生物催化剂反应过程动力学,各节学时分布,第一节 固定化生物催化剂概论：1 第二节 外扩散对反应速率的限制效应：3 第三节 内扩散对反应速率的限制效应：3 第四节 内外扩散同时存在时的限制效应：1,第一节 固定化生物催化剂概论,生物催化剂的固定化 固定化生物催化剂的催化特性 影响固定化生物催化剂特性的因素,1、生物催化剂的固定化1.1 酶的固定化均相酶反应系统的缺点,酶随产物排出，无法重复使用； 增加产物纯化难度； 不稳定，易变性失活,什么是固定化酶？,通过物理或化学的方法使游离酶结合在水溶性或水不溶性的载体上，仍具有活性的酶。,固定化酶的优点,容易从反应体系中分离 可以重复使用 机

2、械强度和稳定性增加 便于连续化、自动化生产,固定化酶技术的发展,1916年Nelson和Griffin发现酵母蔗糖酶能被骨炭粉末吸附并在吸附状态下仍具有催化活性。 首例工业化应用固定化酶：1969年由Chibata及其同事在日本TanakeSciyaku公司实现的，将米曲酶（Aspergillus oryzae）的氨基酰化酶固定后用于拆分合成的外消旋DL-氨基酸，得到相应的旋光性对映体。,生物催化剂作用方式,固定化酶的应用工农业生产的应用,固定化酶的应用医药治疗上的应用,酶的固定化方法,结合法 交联法 包埋法,结合法,物理吸附法 共价键法 离子键法,1）物理吸附法,活性炭、硅胶、硅藻土、陶瓷。

3、 酶活收率高 简便易行 结合力弱，易脱落,操作流程：将酶溶液溶解于缓冲液中，加入载体，振荡或者搅拌一定时间后，抽滤、洗涤、冷冻干燥，得到固定化酶。,2）离子吸附法,离子静电引力 离子交换剂： CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶；各种合成树脂 操作简单 酶活收率高，吸附量大于物理吸附 结合力弱，易脱离,3）共价键法,利用氨基、羟基、胍基、咪唑基等反应活性高的未结合基团。 易失活、酶活收率低 结合牢固,共价键结合法制备固定化酶的“通式”,载体上引进活泼基团 活化该活泼基团 此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键,交联法,酶与具有两个或两个以上官能团的试剂反应 戊二醛,戊二醛交联

4、,苯基二异硫氰交联,特点 不需要载体 反应剧烈，酶活收率低 结合牢固,交联法的形式,2种形式：酶直接交联法 酶辅助蛋白交联 双重固定法 （1） 吸附交联法 （2） 交联包埋法,吸附交联法,先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、酚醛树脂或大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。 用此法所得固定化酶称为壳状固定化酶。,交联包埋法,把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的聚合体，然后用高分子或多糖类物质包埋成颗粒。 避免颗粒太细，同时制得的固定化酶稳定性好。,包埋法,将酶包埋在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内 聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、琼脂,网格型,将酶包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的

5、固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。,微囊型包埋法,将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，也称为微囊化法。,特点 包埋法只适合于底物和产物均为小分子物质的酶的固定化 酶活收率高 制备成本高,各类固定化方法的特点比较,2、固定化生物催化剂的催化特性,2.1 催化活性 一般低于游离酶 空间构象变化；酶分子的空间自由度受到限制；扩散阻力,酶活力收率,实际测定的固定化酶的活力(E3)与固定化时所用的全部游离酶的活力(E1+E2+ E3)之比，包括因未固定化而损失的酶活(E1),酶的活力表现率,实际测定的固定化酶活力(E3)与

6、被固定化的酶在溶液状态时的总活力之比(E2+E3),2.2 催化稳定性 操作稳定性提高 贮存稳定性比游离酶提高 对热稳定性，大多数升高 对分解酶的稳定性提高 对变性剂的耐受力升高,固定化后酶稳定性提高的原因,a. 固定化后酶分子与载体多点连接，防止酶分子变形 b. 酶活力的释放缓慢 c. 限制酶分子的相互作用,2.3 最适温度和pH 最适温度提高 负电荷载体：最适pH较游离酶偏高,2.4 米氏常数 底物与载体电荷性质相反，Km减小,3. 影响固定化生物催化剂特性的因素,酶分子构象的改变 位阻效应 分配效应（微环境效应） 扩散限制效应,酶构象的改变 （难以定量描述与预测，多出现于吸附法和共价偶联

7、法）,位阻效应（屏蔽效应）,载体的孔径太小，或固定化的方式与位置不当，给酶的活性、调节中心造成空间障碍，底物与效应物等无法直接和酶接触。 在酶与载体间加“臂”，可改善。,分配效应,固定化载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物以及其它效应物 在微环境与宏观体系间发生不等分配，改变酶反应系统的组成平衡， 影响酶反应速度。 载体与底物带有相同电荷，反应系统的Km因固定化而增大，反之则减小； 载体带有正电荷时，固定化后，酶活力-pH曲线将向酸性方向偏移，反之向碱性方向偏移； 上述效应可通过提高介质的离子强度而减弱或消除； 采用疏水性载体时，如底物为极性物质或荷电物质，其Km因酶的固定化而升高，如底物为疏

8、水性物质，则Km降低。,分配系数K=Csg / Csi,扩散限制效应：底物、产物及其它效应物的迁移和运转速度受到限制，包括外扩散限制效应和内扩散限制效应。,研究方法,建立包括传质速率和酶的催化反应速率在内的反应速率方程 外扩散 内扩散 内外扩散同时存在,第二节外扩散对反应速率的限制效应,外扩散限制的表观反应速率,研究对象的简化 理论模型,外表面扩散速率（Fick定律） 外表面反应速率 稳态条件下：RsdRsi,引入无因次变量,丹克莱尔准数,定义式 物理意义:判断外扩散控制或反应控制,动力学控制：Da1,外扩散有效因子,外扩散限制与化学抑制同时存在,非竞争性抑制 底物抑制 产物抑制,非竞争性抑制

9、,负协同效应,例 ：某酶固定在无微孔球形基质上，其本征动力学参数为Vmax=4X10-5mol/(L S),Km=2X10-5mol/L. Sb= 1X10-5 mol/L, kLa= 0.4 s-1, 求SS和底物在固定化酶外表面上的反应速率？,解题思路：这是一个外扩散限制下的固定化酶动力学问题，当体系达到平衡时，外扩散速率与球体表面上的本征反应速率一致，因此，,将已知条件代入得：,变换为一元二次方程后求解得：SS=0.18x10-5mol/L 所以vsurface=kLax(Sb-SS)=0.4x(1-0.18)x10-5 =0.328x10-5 mol/(L s),第三节 内扩散对反应速

10、率的限制效应,内扩散问题的引出,液体在载体微孔内的扩散,以浓度差为推动力 Knudson扩散 分子扩散（Fick定律） 有效分子扩散系数 De,微孔内的浓度分布（球状固定化酶）,简化假设 载体和酶均匀分布 等温、等De 不考虑酶的失活 扩散传质 浓度是半径的函数,S流入速率S流出速率S消耗速率,解与rs有关,一级反应,方程的解,常数的求解,颗粒内底物浓度分布函数,内扩散有效因子,球形固定化酶,一级反应,梯勒模数,定义式 物理意义 动力学控制 内扩散控制,影响内扩散效应的因素,一级反应的梯勒模数通式,零级反应,临界半径Rc 最大颗粒半径Rmax,零级反应,M-M方程,无解析解，只有数值解,第四节 内外扩散同时存在时的限制效应,一级不可逆反应,一、总有效因子,实际反应速率/本征反应速率,总有效因子的推导,传质速率以外表面底物浓度为基准的反应速率,以外表面底物浓度为基准的反应速率以主体溶液