VEGF的生物学基础与朗沐药学.ppt

1、a，1，VEGF生物科学基础和朗沐药学基础知识，陶a，2，片计程仪，a，3，VEGF的定义，VEGF:vascularendotheelialgrowthfactor，血管内皮生长因子是多功能细胞因子，血管生成和淋巴管生成VEGF主要有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和VEGF七种亚型。 其中只有VEGF-A、VEGF-B和PlGF与血管生成有关。a、4、VEGF的分子结构、VEGF-A的基因剪切接合后，可以形成不同的单体，例如121、165、183等。 数字表示对应的氨基酸残化学基的数量。 其中VEGF165是眼部新

2、生血管的主要诱因。 VEGF通常以同源二聚体存在，两个亚单位的分子质量(MW )为1723 kDa，以两对二硫键共价键合。 也写作kDa: kiloDalton、千道尔顿、kD。a、5、VEGF的合成和靶细胞，分布在眼睛的血管组织都可以合成表达VEGF，相关细胞球有视网膜色素上皮细胞球(RPE )、周细胞(也称为周细胞球)、内皮细胞球、缪尔细胞球和基质细胞等。 VEGF的主要靶细胞是血管内皮细胞、RPE、视网膜外层、镜细胞球、视网膜中层、视网膜内层、视网膜感觉神经细胞球、a，6，VEGF的作用；1. VEGF促进血管内皮细胞的增殖、移动和生存；2. VEGF增加血管通透性，扩张血管；3. VE

3、GF收集血管祖细胞和单核细胞、a，7，VEGFR的定义，VEGFR:vascularendotheelialgrowthfactorrceptor，血管内皮生长因子接纳体，一种接纳体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，与VEGF结合后，通过构象变化和磷酸化传递信号。 VEGFR主要有VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3三种亚型。 VEGF刺激内皮细胞球增殖，增加血管通透性和新血管的生成作用主要是通过结合VEGFR-2激活来实现的。 VEGFR-3不涉及血管生成信号路径。a、8、VEGF接纳体的分子结构、VEGFR通常以单体存在。 分为细胞球外区、跨膜区和细胞球内区三大部分。 细胞球外区部分由类似免

4、疫球蛋白(immunoglobulin，Ig )结构的7个结构域构成。 细胞球内区的一部分属于酪氨酸酶区，可以产生自我磷酸化向下游传递信号。a、9、VEGF接纳体的分子结构、VEGFR的细胞球外区的7个免疫球蛋白样结构自n端起依次命名为D1-D7。 VEGFR-1(Flt-1 )可以与VEGF-A、VEGF-B和PlGF结合，其D2区是与配体结合的部位。 VEGFR-2(KDR，Flk-1 )只能结合VEGF-A，其中D2和D3区是配体结合部位，D3区作用于配体结合的专一性。 D4区对于接纳体的二聚化很重要，可以增强VEGF和VEGFR的结合速度。 D1、D7、a、1.0、VEGF与眼部新生血

5、管疾病有关，脉络膜新生血管膜中检测出VEGF165、VEGF-B和PlGF的证据PDR (增殖性糖尿病网膜疾病)患者的玻璃体腔中的PlGF浓度明显上升，如果在眼内注射VEGF，微动脉瘤、出血根据以上说明，VEGF与眼部新生血管疾病有关：1.从通透性到新生血管的建构，视网膜脉管系统的病情变化与VEGF表达量的增加有关。 只有VEGF才能诱发眼内新生血管形成。 抑制VEGF改善眼睛的功能和构造。 a、1.1、VEGF表达增加的诱因、缺氧、炎症和机械功率可使细胞球合成VEGF升高。a、1.2、VEGF的作用机制，VEGF与VEGFR结合，通过D4区发生二聚化现象，VEGF连接在接纳体的D2区或D2与

6、D3区之间。a、1.3、VEGF的作用机制，VEGF与VEGFR的结合引起接纳体的构象变化和自我磷酸化，可使下游蛋白磷酸化，并传递血管生成与血管渗漏的信号。p、p、a、1.4、眼部新生血管系统疾病种类、VEGF诱发的病态血管生成疾病主要分为肿瘤和眼部新生血管失调两种. 眼部新生血管疾病根据临床表现可分为增生型(Proliferation )、渗漏型(leakage )和增生渗漏型(Proliferation and leakage种。增殖型眼病：增殖型糖尿病网膜疾病(PDR )、早产儿网膜疾病(ROP )、新生血管性青光眼(NVG )漏出型眼病：视网膜静脉闭塞(RVO )、糖尿病黄斑浮肿(DM

7、E )、中心性浆液性脉络膜网膜疾病(CSC )增殖漏出型眼病：湿性年龄相关黄斑变性(wAMD )、视网膜血管瘤增殖(RAP )病理性近视、a、1.5、眼部新生血管系统疾病的拮抗途径，1 .消除导致VEGF表达量增加的条件：全视网膜激光光凝术、玻璃体切割术改善视网膜内氧环境，降低低氧诱导VEGF表达2 .降低VEGF和VEGFR的表达：眼内注射曲安奈德、地塞米松3.VEGF 贝伐单抗、雷尼单抗是结合所有VEGF-A的阿巴吉普车，康柏吉普车是结合所有VEGF-A、VEGF-B和PlGF。a、1.6、康柏西普的生物科学和药学基础、a、1.7、康柏西普的起源、抗VEGF药物的阻断途径：1.结合VEGF

8、不能与VEGFR结合2 .结合VEGFR不能与接纳体结合的单抗类药物采用阻断途径1，采用杂交瘤细胞细胞球技术获得。VEGF-A、贝伐单抗、Avastin、雷珠单抗、Ranibizumab、a、1.8、雷珠单抗生产技术、雷珠单抗和贝伐单抗最初采用单克隆抗体技术进行筛选。 单克隆抗体技术又称杂交瘤细胞细胞球技术，是一种小鼠脾细胞球与小鼠骨髓瘤细胞融合产生抗体的技术。 小鼠脾细胞球受特定抗原(VEGF )刺激分泌细胞相应的抗体(抗VEGF抗体，如白塞特单抗)，但小鼠脾细胞球不能增殖，需要较多的稳定单抗，融合脾细胞球和可无限增殖的肿瘤细胞球，分泌抗体，保持细胞永生。 VEGF刺激小鼠脾细胞球，产生的抗

9、体必须有小鼠来源的氨基酸排列顺序。 并且由于抗体的偏差，根据下面的刺激有可能产生不同的抗体，所以最终从多个抗体中筛选贝伐单抗和雷珠单抗的整体。 并对这两个单抗的氨基酸排列顺序(雷珠是Fab片段的序列)进行鉴定，基于基因密码子表获得相应的DNA，将DNA序列移植到大肠菌群中诱导表达，就可以大量培养稳定的雷珠单抗。 之所以在大肠菌群中表达蛋白质，一般是因为迅速、方便、稳定、廉价。a、1.9、康柏西普的起源、抗体存在两个问题：1.抗体的专一性只能与VEGF的亚型VEGF-A结合而不显示VEGF-B与胎盘生长因子(PlGF )的亲和力2 .杂交瘤细胞细胞球技术生产的抗体氨基酸的部分组成及序列来源于小鼠

10、，在全人蛋白质中、a、2.0、康柏西普的起源、VEGF的各亚型通过结合VEGFR-1和2发挥作用。 模拟接纳体和VEGF结合位点的结构，降低免疫原性，并可与所有VEGF亚型结合. 由于VEGF R1和2的细胞球外结构域与VEGF上不同的位点结合，因此该模拟接纳体需要融合VEGF R1和2种蛋白质的配体结合位点，完全抑制VEGF与接纳体的结合。 a、2.1、康柏西普的起源，FP3表现出最高的VEGF亲和力，显示出最强的抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC )增殖的能力。 VEGFR-1 VEGFR-2，a，2.2，康柏西普的分子量约为143kD，其接纳体样区域为同源二聚体样结构，VEGFR和VEGF

11、结合的活性形态康柏西普的7个糖基化部位糖基化，眼睛刺激性小的D4区，使康柏西普的pI值为5.68-7.47 康柏西普的结构、a、2.3、康柏西普的制备技术、康柏西普最初是将人VEGF接纳体1和接纳体2的细胞球外免疫球蛋白样区域随机融合，从与人IgG fc片段的融合蛋白中筛选出来的。 这种融合是通过将表达这些个蛋白质区的DNA序列在连接酶催化剂中有序地结合，移植到中国仓鼠卵巢细胞中诱导表达而获得的。由于DNA所对应的蛋白质均为人源蛋白质，因此康柏西普100%为人源蛋白质。 之所以选择中国仓鼠卵巢细胞，一是因为大肠菌群没有能正确折叠真核蛋白质进入活性状态的酶催化剂，表达的分子不溶，没有活性，CHO

12、作为真核细胞，有这些个的酶催化剂，第二是康柏西普蛋白有多个糖基化部位， 大肠菌群不能糖基化人来源的糖基化部位，也影响蛋白的状态和活性，第三，中国仓鼠卵巢细胞表达技术是目前真核表达细胞球中比较成熟稳定的技术，用于工业生产。a、2.4、康柏西普的活性研究、康柏西普的体外活性研究、a、2.5、康柏西普的体外活性研究、ELISA对FP1、FP3和贝伐单抗VEGF的亲和力、FP1 :阿柏西普； FP3:康柏西普、康柏西普显示出更高的VEGF亲和力。 贝伐单抗的专一性不能与VEGF-B和VEGF-C及PlGF结合。 a、2.6、康柏西普： EC50=28 pM雷珠单抗： EC50=50 pM EC50 :

13、半数有效浓度，即能引起50%最大效果的药物浓度。 EC50的值越大，表示药物的作用越低。 康柏西普和雷珠单抗VEGF诱导的HUVEC增殖活性、康柏西普的体外活性研究、a、2.7、康柏西普对HUVEC迁移的抑制作用表现出剂量依赖性，其IC50为7nM。 IC50 :半数的抑制浓度，即引起50%抑制效果的药物浓度。 IC50的值越大，表示药物的作用越低。 康柏西普对VEGF诱导的HUVEC细胞球迁移过程的影响，康柏西普的体外活性研究、a、2.8、康柏西普可显着抑制VEGF诱导的微血管萌发和毛细血管样网络形成。 康柏西普对VEGF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成的影响，康柏西普的体外活性研究、a

14、、2.9、500ng/ml康柏西普可最大程度地完成人视网膜内皮细胞球(HREC )分泌细胞的VEGF165作用，显着降低游离PlGF浓度。 康柏西普对高糖诱导的HREC分泌细胞VEGF-165和PlGF的影响，康柏西普的体外活性研究，a、3.0、500ng/ml的康柏西普可有效抑制高糖诱导的HREC迁移。 康柏西普对高糖诱导HREC迁移的影响有：康柏西普的体外活性研究、a、3.1、500ng/ml康柏西普可有效抑制高糖诱导HREC形成毛细血管样网络。 康柏西普对高糖诱导的HREC成网过程的影响表明，康柏西普的体外活性研究、a、3.2、康柏西普治疗组漏出明显少于未治疗组，表明康柏西普能够抑制新生

15、血管的生成。 缺氧诱导小鼠缺血性网膜疾病抑制实验眼底造影，康柏西普体内活性研究，a、3.3、激光后立即注射康柏西普，其后b组每周注射一次，c组每周注射一次。 b组和c组漏出明显少于未治疗组，提示康柏西普可预防新生血管生成。 康柏西普预防恒河猴激光烧伤的CNV实验眼底造影、康柏西普体内活性研究、a、3.4、康柏西普抑制恒河猴激光烧伤的CNV实验OCT结果、激光烧伤2.0天后，治疗组分别注射康柏西普500、300和100 g 与对照组相比，8 d后治疗组未见高反射回声区，RPE恢复连续性，黄斑浮肿消除，康柏西普能有效抑制CNV。 康柏西普的体内活性研究，a，3.5，康柏西普抑制恒河猴激光烧伤的CN

16、V实验FFA结果-500 g组，激光烧伤2.0天后，注射0天，注射1.4天后，注射2.8天后，康柏西普的体内活性研究，a，3.6，张明，et al.ophthalmming 118(4):672-8 .康柏西普治疗后4.2，患者BCVA平均提高19.61个字符。 中央视网膜的厚度平均下降了77.19 m。康柏西普的体内活性研究、a、3.7、康柏西普3.0mg组患者基线和治疗4.2后OCT和FFA结果、张明、et al. Ophthalmology. 2011 Apr； 118(4):672-8 .康柏西普的体内活性研究、a、3.8、康柏西普的药物代谢动力学研究、康柏西普的兔眼药水代动力学研究、

17、a、3.9、重要药物代指标： Cmax :最大药物浓度，给药后体内检出的最大药物浓度。 Tmax :达到峰值时间、达到Cmax的时间、所需时间越短，表示药物的分散越快。 t1/2 :药物的半寿期、药物浓度减半所需要的时间、值越大表示药物在体内残留的时间越长。药物代谢动力学指标a、4.0、康柏西普的兔眼药水代动力学研究，玻璃体腔0.5mg(A，Group 1)和1.5mg(B，Group 2)康柏西普对玻璃体、房水、脉络膜-PRE、视网膜注射药物代参数，康柏西普对玻璃体腔注射后， 说明在6-12h内达到各组织中最高的药物浓度，然后以单指数模式下降，根据浓度梯度迅速分散到玻璃体腔和周围组织中。 雷珠单抗在玻璃体腔的Tmax为24h，而Cmax仅为162g/mL，t1/2为2.88天。 a、4.1、康柏西普的兔药物代谢动力学研究，康柏西普血清中的时辰药浓度，组1:玻璃体腔注射0.5mg组23360玻璃体腔注射1.5mg组：静脉注射3mg玻璃体腔后，血清中康柏西普的浓度低，6-12 静脉注射后康柏西普以双指数模式解除，半寿期短于玻璃体腔注射。 对a、4.2、健康猴子一次性注射康柏西普，分别于2、7、1.5测定眼组织中康柏西普浓度。 结果表明，注射后1.5眼部组织亦可检测出康柏西普，玻璃体腔中浓度最高，玻璃体腔中的康柏西