第四章 基因工程载体.ppt

1、,第三章 基因工程载体,vectors,在基因工程操作中，通过不同途径能将承载的外源DNA片段带入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子叫载体。,1. 载体 （Vectors）,（1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。,（3）有一段多克隆位点。,2. 基因工程对载体 的要求,外源DNA插入其中不影响载体的复制。,（4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 (6) 安全性,基因工程中常用的载体有5类：,3. 载体 的种类,质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）,第一节 质粒载体,一、质粒（pl

2、asmid）,是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。,存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。,大肠杆菌的质粒,（1）分子大小：,1. 质粒的一般生物学特性,1500 kb,（2）特殊功能基因：,23个中等大小的蛋白质。,（3）环形状：,双链闭合环状DNA。,（酵母的“杀伤质粒”是RNA）。,如抗菌素抗性、抗重金属离子等，赋予细菌一些额外的特性（非必须）。,（4）质粒的空间构型：, 共价闭合环状DNA（cccDNA),呈超螺旋（SC）（super coil）,Covalent close circular DNA, 线形DNA （ linear ，lDNA）,一条链上有一至数个

3、缺口。, 开环DNA（ open circular， ocDNA）,（5）质粒空间构型与电泳速率,同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：,scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。,SC,OC,L,二、质粒的类型,在大肠杆菌中的质粒，可以分为：,接合型质粒:,非接合型质粒,能自我转移,不能自我转移,除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,如：F质粒（性质粒、或F因子）：,甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。,又叫自我转移型质粒。,1. 接合型质粒：,不符合基因工程的安全要求。,大肠杆菌接合（conjunc

4、tion）,2. 非接合型质粒：,虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。,（1）R质粒（抗性质粒）：,带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。,符合基因工程的安全要求。,带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。,（2）Col质粒：,大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。,Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。,三、质粒的复制类型,1. 严紧型质粒（stringent plasmid）,拷贝数少，只有13份拷贝。,2. 松弛型质粒（relaxed

5、 plasmid）,拷贝数多，有1060份拷贝。,（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。,（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。,（1）分子量大，拷贝数低,四、质粒载体的构建,1. 天然质粒的局限性,第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。,但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。 作为克隆位点的限制性内切酶的识别序列一般在质粒克隆载体上只有一个,（2）筛选标志不理想,colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。,唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部。,Colicin E1,外源DNA,无Colicin,

6、大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）ColE1imm, colicin E1基因的结构,cea,imm,kil,结构基因,免疫基因,溶菌基因, 杀死不含有ColE1细菌的原因,cea + kil基因产物, 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因,imm基因,ColE1,抗 colicinE1,杀ColE1-,仍抗 colicinE1,不杀ColE1-,插入片断,ColE1,可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞.,ColE1,（1） 具有复制起点（ORI）,2. 质粒载体必须具备的基本条件,（2）具有标记基因,（3）若干限

7、制性内切酶的单一位点：,理想的载体应该有两种标记基因。,用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。,（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。,氨苄青霉素抗性（Ampr）Ap 卡那霉素抗性 （Kanr）Km 四环素抗性 （Tetr）Tc 链霉素抗性 （Strr）Sm 氯霉素抗性 （Cmlr）Cm,3. 质粒的选择标记及其工作原理：,（1）选择标记, 抗菌素抗性,绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：,10,常用抗菌素的抗性工作原理,i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。,通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。,a）抑菌原理,b）细菌抗性原理,Ampr基因

8、编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。,ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）,通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,b）细菌抗性原理,Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。,a）抑菌原理,a）杀菌原理,iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）,通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。,b）细菌抗性原理,Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。,iv）链霉素（Streptomycin，Str）,a）杀菌原理,通过与30S核糖体亚基结合，导致mR

9、NA错译。杀死细菌。,b）细菌抗性原理,Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。,v）四环素（Tetracycline，Tet）,b）细菌抗性原理,a）抑菌原理,通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。,Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。,当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。,不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。,（2）抗菌素选择原理,活,死,抗性基因,抗菌素,4. 不同类型的质粒载体,（1）高

10、拷贝数的质粒载体,ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。,而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂-氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数10003000个！,适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。,（2）低拷贝数的质粒载体,但有特殊用途:,由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。,当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。,pLG338、pLG339、pHSG415等,不适合大量扩增DNA用。,（3）失控的质粒载体,这是一类温度敏感型复制控制质粒。,温度低（低于30 oC），拷贝

11、数很少； 温度增加（35 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。,如pBEU1、pBEU2。,runaway plasmid vectors,1979年B. E. Uhlin等构建。,（4） 插入失活型质粒载体,载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。,如pDF41、pDF42、pBR329。,抗菌素抗性,外源DNA,无抗菌素抗性,（5）正选择的质粒载体,如pUR2、pTR262等。,只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。,一类具有直接选择标记并可赋予寄主细胞相应表型的质粒载体。,目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。,Direct selection vec

12、tors,（6） 表达型质粒载体,按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核 基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应 蛋白质的克隆载体特称为表达载体。 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物,注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。,如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。,复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS,2）大肠杆菌表达质粒载体元件,阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区,1）普通载体元件, 表达载体的结构,五、经典的大肠杆菌质粒载体,pSP2124质粒的

13、Ampr基因,1. pBR322：,（1）元件来源,F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。, 复制起点 ori,pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点, Ampr基因, Tetr基因,pSC101的Tetr 基因。,（2）长度,4363bp,（3）选择标记,氨苄青霉素和四环素抗性。,（4）克隆位点,其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。,24个克隆位点。,（5）pBR322的优点, 双抗菌素抗性选择标记,插入失活，分两次先后选择：,没有获得载体的寄主细胞

14、在Amp或Tet中都死亡。,获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。,外源基因BamH I,Amp中存活,但在Tet中死亡,外源基因Pst I,Tet中存活,但在Amp中死亡,转化处理受体菌,无Amp和Tc,Amp,Tc,Pst I,氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy, 安全,失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。, 高拷贝数, 分子小，克隆能力大,载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。,保留了转移蛋白（mob）的作用位点(bom)。,（6）pBR322的缺点,能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒

15、的参与，就有可能转移！, 删除mob识别位点,（如质粒pBR327、pAT153等）。,（7）PBR322的改进,pBR325：,在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。,使EcoRI 也成为插入失活型位点。, 改造EcoR I 位点,2. pUC系列,University of California的J. Messing和J. Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19, 复制起点,pBR32

16、2的 ori,但其上失去了克隆位点。, Ampr 基因,（1）元件来源, lacZ的启动子,大肠杆菌, lacZ基因,lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。,pBR322的Ampr基因,（2）长度,约2.7kb,（3）克隆位点,连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。,pUC18/19,Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。,（4）选择标记,蓝白斑选择原理：, Xgal,（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）,-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。,Xga

17、l,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,-半乳糖苷酶, -半乳糖苷酶Xgal显色反应：, lacZ的肽互补,1）-肽（ lacZ ）：,-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。,lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,C端大部分,N端的11-41aa,4聚体,2）受体菌lacZ突变（lacZM15）,受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal,受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、

18、MV1184、DH5a,pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。,C端大部分,N端的11-41aa,pUC lacZ,受体菌lacZM15,3）载体lacZ与互补,4）互补的插入失活,pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。,lacZ,5,3,肽移码突变,lacZ,5,3,肽,不互补,互补,MCS,外源DNA, IPTG的诱导作用,IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分

19、和载体的lacZ肽都表达。从而互补。,但载体MCS上插入外源DNA后，不能产生肽！,IPTG,通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。,MCS无插入时，互补 MCS有插入时，不互补,IPTG诱导的结果：,蓝菌斑,白菌斑,（5）pUC系列载体的优点, 更小的分子量和拷贝数：,如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。, 选择方便,Xgal显色、抗菌素双重直接选择。, 克隆便利,具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。, 测序方便,pUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。,M13mp18的多克

20、隆位点,六、其它质粒载体,1. pGEM-3Z,由pUC派生而来。,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。,T7启动子,SP6启动子,MCS,lacZ,Ampr,ori,可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。, 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA, 外源基因正接反接都可以转录。, MCS与pUC18的完全一样。,2. pGEM-4Z：,与pGEM-3Z相同，只是T7启动子和SP6启动子的位置互换。,（1）pGEM-3Z的特点：,3. 穿梭质粒载体,（1）穿梭质粒载体的结构,人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两

21、种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,（shuttle plasmid vectors）,Yeast复制起点,E.coli复制起点,E.coli选择标记,Yeast选择标记,MCS,大肠杆菌枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌酿酒酵母穿梭载体 大肠杆菌动物细胞穿梭载体,（2）常用的穿梭质粒载体,（3）穿梭载体的优点, 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。, 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。,克隆、构建,表达,E.coli,Animal cell, 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达,七、质粒载体的不稳定性,1. 质粒稳定遗传必须的两个条件：,（1）每个世代、

22、每个质粒至少要复制一次,（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分 配到两个子细胞中。,有主动分配和随机分配两种假说。,（1）主动分配,天然质粒。,2. 质粒分配方式,具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。,人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。,人工质粒。,（一般情况下也能保证质粒的稳定遗传）,（2）随机分配,但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。,在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。,3. 分离的不稳定性,（segregation instability）,4.

23、结构的不稳定性,（structural instability）,寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。,IS,dimer,重组,（1）新陈代谢负荷：,5. 影响质粒载体稳定性的主要因素,使寄主细胞生长减缓：,质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。, 复制负荷,减缓的程度与质粒的分子量成正比。, 转录和翻译负荷,丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！,每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。,（2）质粒载体的拷贝数,低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。,差度（variance）：,是产生无质粒细胞的重要原因。,高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体

24、多，发生丢失的可能性大。,野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。,（3）寄主菌的重组体系,二聚体灾难（dimer catastrophe）：,含有大分子量插入片断的质粒载体普遍能形成质粒寡聚体。,二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。,第二节 噬菌体载体 P60,噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。,一、噬菌体的一般特性,结构： 蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。,T4 Bacteriophage,分为两种：,1. 溶菌周期：,二、噬菌体的生活周期,感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，

25、并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。,烈性噬菌体（virulent phage),2. 溶原周期：,感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization)。,整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。,温和噬菌体（temperate phage),原噬菌体（prophage)：,三、单链噬菌体载体,M13、f1、fd 噬菌体,单链DNA的丝状大肠杆菌噬菌体：,M13 噬菌体,（2）复制型（RF）是双链环状DNA。,1. 单链DNA噬菌体的特点,（3）RF DNA和ssDNA都能转染感受态 大肠杆菌。并产生噬

26、菌斑。,（5）可产生大量的含有外源DNA插入片 断的单链分子，便于作探针或测序。,（1）+DNA。（ssDNA）,（4）不存在包装限制。,2. M13 噬菌体,RF dsDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。,成熟的噬菌体里只包装有 + DNA，也容易提取。,M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。 但M13 DNA可以转染雌性大肠杆菌。,6407 bp。,（2）DNA长度,（3）DNA提纯,（1）寄主,M13序列,（4）M13的生活周期,虽然不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，约为正常的1/23/4）,M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA,+DNA合成DNA，形成RF dsDNA,DNA转录m

27、RNA、翻译形成噬菌体蛋白、合成+DNA,组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞,+DNA,-DNA,mRNA,M13外壳蛋白,组装成子代M13,+DNA,注入大肠杆菌,复制,转录,翻译,+DNA,指导合成,+DNA,200个 RF DNA,每个细胞可以放出约1000个M13颗粒！,M13的包装过程：,RF dsDNA指导合成的+DNA,M13基因V编码单链DNA结合蛋白,DNA-蛋白质复合物,转移到寄主的细胞膜,M13外壳蛋白,基因V蛋白脱落,+DNA,溢出细胞膜,包装,（5）没有包装限制,3. M13载体的构建：,M13基因组中基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。,（1）克

28、隆区域的选定, 基因间隔区（intergenic region, IG区）,IG区内只有一个 BsuI 切点。,其余9个BsuI限制性位点分布在其它部位。, 酶切位点,M13,J. Messing证明，IG区存在M13的复制起点，但可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力。,在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（-肽序列)。 利用-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。,（2）加入酶切位点, 在IG区内加入单一内切酶位点,第一个M13载体：M13mp1：,M13 RF,BsuI不完全消化,各种长度的线性片断,（其中应有只在IG上切开的线性全长M13）,E

29、.coli lac基因的HindII片断(lacI、lacP、lacO、lacZ）,连接,M13mp1,JM101宿主,只有在IG区插入lacZ才能存活并在Xgal上出现互补的蓝噬菌斑,（3）M13载体系列,加上常用的酶切位点。, M13载体系列的命名,M13mpn n代表系列数字, 对M13mp1的改进,B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ 5端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点。,M13mp2：, 对M13mp2的进一步改进,在M13mp2的LacZ的5端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。,M13mp7、M13mp8、M13mp9、

30、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19,对应有相同MCS的pUC系列载体：,pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19,成为M13mp系列载体：,12,与pUC18相同,M13mp18的多克隆位点,4. M13系列载体的优点,（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段,（2） Xgal显色反应，可供直接选择,（3）无包装限制，克隆能力大,（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链,子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。,MCS,+,-,+,-,+,-,编码链,非编码链,外源DNA,不同的酶切,不同的酶切,插入,M13 vector,M13

31、RF,+,-,+,-,+,-,外源DNA,转染E. coli,成熟的子代M13中,+,+, 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降, 外源 DNA 总是以单方向插入,5. M13载体的缺点,6. 噬菌粒载体（phagemid vectors）,由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。,MCS,噬菌体ori,质粒ori,Ampr,lacZ,lacI,约3000bp（比M13小）,克隆能力大,能插入10kb的外源DNA。,两种复制形式,分子量小,（1）噬菌粒载体的特点,既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。,既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能以噬菌体进行单链复制。

32、,（2）常见的噬菌粒载体,辅助噬菌体用来复制和包装噬菌粒载体。,（3）pUC118/pUC119, 构成,1）M13的基因间隔区（IG）,2）pUC18/pUC19质粒载体：,带有M13复制起点。,质粒复制起点 Ampr lacZ MCS,MCS,pUC18/pUC19 ori,Ampr,lacZ,lacI,M13 ori,3.2kb,pUC118/119, pUC118/119的复制模式,两种不同的复制模式,1）双链质粒复制模式,受pUC本身的复制起点（来源于ColE1）的控制。,每个细胞能达到500个拷贝。,来源于M13的复制起点被辅助噬菌体的基因II产物控制。,2）单链滚环噬菌体复制模式

33、,外壳蛋白,复制蛋白,辅助M13,包装,当寄主细胞被辅助噬菌体M13感染后。, 噬菌粒载体的包装,1）辅助噬菌体：,自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。,如M13K07等。,2）包装：,辅助噬菌体,外壳蛋白和 复制蛋白,噬菌粒载体,ssDNA,噬菌体,（4）pBluescript 噬菌粒载体（pBS）,Stratagene公司发展的一类噬菌粒载体。,由pUC质粒载体、f1噬菌体的复制起点和T3、T7噬菌体的启动子组成。, 特点, 组成,MCS两侧分别加上T3和T7噬菌体的启动子。加入适当的噬菌体RNA聚合酶，就可以定向体外转录。,

34、1）定向体外转录,2）两种复制模式,既能以质粒的形式复制，又能以噬菌体的形式复制包装。,3）选择方便,有Ampr和lacZ，可以进行Amp抗性选择和Xgal-IPTG蓝白斑选择。,4）插入方便,18个单一酶切位点的MCS,SK：表示lacZ的转录方向是沿MCS上的 SacI KpnI,+（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ，能回收lacZ的编码链（+）,pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-）,KS：反向（ KpnI SacI ，MCS相反）,-（f1-）：能回收lacZ的非编码链（-）,1）pBluescript SK/KS（+/-）区分：, 常用

35、的 pBluescript 载体,pBS SK+,pBS KS-,（4）PCR产物克隆载体 T 载体,pCR系列载体,Invitrogen公司开发的线性噬菌粒载体。, 结构,pUC的质粒部分、f1噬菌体ori、Kanr和Ampr抗性。,MCS的中部已经切开，各有一个5端突出的T。, 特点,PCR产物往往在3端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。,pCR2.1,pCR2.1的MCS,克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下来回收。,Promega 公司的T载体系列,pGEM-T vector,T vector的克隆过程简便！,A,A,T,T,T vector,PCR product,T4 DN

36、A ligase,A,A,四、双链噬菌体载体载体,（1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）但在两端有cos位点，可以环化。,DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。,1. DNA分子的特点,cos位点（cohensive-end site）：,DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF DNA）。,噬菌体和其DNA,DNA上有至少30个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。 其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。,2. 噬菌体的基因组特点,噬菌体感染细菌的早期：双链进行型复制。,3. DNA的复制

37、 模型,（1） 型复制,（2）滚环复制,感染的晚期：启动滚环复制机制。,形成多联体DAN分子。,这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。,（1）构建原理：,4. 噬菌体载体的构建,（2）构建过程,在这个非必须区内制造限制酶切点 引进某些突变表型，作为选择标记 突变某些基因，使它成为安全载体 删除DNA必须区段上常用的限制酶切点,噬菌体DNA上本身有5个 EcoR I 和7 个Hind III切点！,删除噬菌体的非必需区，留出插入空间。,（3）人工构建的噬菌体载体有两种类型：, 插入型载体（insertion vectors)：,如 gt10、gt11、BV2、NM540、

38、NM1590、NM607,1）免疫功能失活型：,插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。,EcoR I,gt10,插入导致载体不能合成阻遏物，载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 没有外源DNA插入的载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。,选择标记:,如NM1149载体的两个克隆位点（EcoR I 和Hind III）都是位于cI基因内部。,2）-半乳糖苷酶失活型载体：,在基因组中引入了LacZ序列。（其上含有一个EcoR I 克隆位点）。,感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。,EcoR I,Charon16A,选择标记:,

39、 替换型载体（substitution vectors),两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于DNA的非必须区两端。,用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片断置换。,可置换区,MCS,MCS,如： EMBL4、Charon40等。,13,载体克隆策略,置换型载体, DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。,5. 载体的体外包装,在试管中噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。,必须利用噬菌体外壳的作用！,（1）体外包装：,的D基因的产物也是头部蛋白，但主要与 DNA 进入头部和头部的成熟有关（只占20%）。,

40、（2）体外包装过程, 噬菌体外壳蛋白的合成,E 基因,的E 基因编码头部蛋白的主要成分（占头部总蛋白的70%）。,D基因,噬菌体感染细菌形成的噬菌斑,1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid), DNA：,46kb,（1）大小,（2）组成,6. cosmid载体（粘粒）,cos序列和控制包装的的序列。,pBR322：,质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点,1978年J. Collins和B. Hohn等人发展出cosmid vector（cos site-carrying plasmid)

41、, DNA：,57kb,（1）大小,（2）组成,6. cosmid载体（粘粒）,cos序列和控制包装的的序列。,pBR322：,质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点,具有噬菌体的特性：,（3）cosmid vector的特点,克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。,在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌 ）。,具有质粒载体的特性：,大多带有pMB1或ColE1的复制子，能象质粒一样复制。,有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。,方便的选择：,高容量的克隆能力：,45kb （最少不能低于30kb）。,51kb-5kb=45kb,（4）部分cosmid vec

42、tor,应用cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片断的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（cosmid cloning）。,（5）cosmid cloning,理论依据：,cos位点:,噬菌体的生命周期中，会产生数百个DNA通过cos位点连接的“多联体”分子。,“多联体”复制：,包装识别。,在包装的时候， 噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase）体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个DNA长度。,两个cos位点之间，必须保持3851kb的DNA，Ter体系才能识别。,Ter体系：,包装限制：,用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。,（6）cosmid克隆的一般过程,用同样

43、的内切酶消化cosmid载体。,连接,产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。,切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。,注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。,感染大肠杆菌, Ter体系识别并切割,大质粒！,载体片断自我连接。,外源DNA片断自我连接。,多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体。,（7）cosmid载体克隆的缺点,用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5端的磷酸，可防止载体自体连接。,克服载体自体连接的改良方案：, Ish-HorowiceBurke改良方案,1981年，D. Ish-Hor

44、owice和J.F. Burke 。,（8）cosmid载体的改良,在BamH I位点两侧各有一个EcoR I切点。,1）突出的特点：,pJB8 cosmid载体,使克隆在BamH I上的外源DNA可被EcoR I切下来。,包装识别,2）Ish-HorowiceBurke方案克隆过程,HindIII,SalI,SalI,HindIII,BamHI,a. 需要脱磷酸化处理。,b. 电泳纯化载体两臂。,c. 载体两臂的最终得率少的可怜！,2）Ish-HorowiceBurke方案的缺点,防止载体自我连接,第二次酶切后。,a. 需要脱磷酸化处理。,b. 电泳纯化载体两臂。,c. 载体两臂的最终得率少

45、的可怜！,2）Ish-HorowiceBurke方案的缺点,防止载体自我连接,第二次酶切后。,Bates-Swift 克隆过程：,第三节 大分子DNA克隆载体,A.W.Murray 1983年形成基础理论, D.T.Burke等1987年变为现实。,一、酵母人工染色体,1. YAC的特点：,（1）只能在酵母细胞中扩增。,（yeast artificial chromosome, YAC),（2）克隆容量大，为230kb-1700kb。,（3）构建原理，按染色体结构构建。,（1）DNA复制起始点（ori）,2. 染色体复制和遗传的三个基本组件：,TEL,TEL,CEN,ORI,（2）着丝粒（ce

46、ntromere，cen）,（3）两个端粒（telomeres，tel）,Leu,ARS,CEN,Leu- Yeast,后代死,Leu- Yeast,80%后代死,Leu- Yeast,后代活,Leu- Yeast,后代死,Leu- Yeast,后代活,Tel,Tel,（1）着丝粒区（CEN）,A A GTCACGTG,T TGTTTCTGNTTTCCGAAA,3. YAC的组成结构,酵母染色体着丝粒区的保守序列:,78-86bp,I,II,III,由三个区组成,酵母第3、4、6、11号染色体的着丝粒区序列：,酵母端粒保守序列是(G4T2)n 重复序列。,（3）复制起点（ORI）,约100bp

47、的自主复制序列（ARS）。,（2）端粒（TEL）,人是TTAGGG重复序列; 四膜虫是 GGGTTG重复序列。,（真核生物中只有酵母菌有ARS）,两个端粒序列Tel。,位于 SUP4 基因内部。,（4）克隆位点,插入失活选择：,SUP4酶失活的酵母菌落呈红色； 不失活的菌落是白色。,14,TRP1、URA3（分别位于两臂）。,细菌的复制起点 ori和抗生素标记Ampr,（5）在酵母中的标记基因,（6）在细菌中操作,4. YAC克隆外源DNA,URA3,TRP1,CEN4,（1）宿主酵母菌：,只有同时得到YAC的两个臂，才能在基本培养基（不加TRP和URA）上生长。,（2）选择方式,5. YAC

48、转化过程,trp- 和 ura-,cen,ura3,trp1,（1）存在插入子的稳定性问题。,6. YAC的缺点：,（2）同一酵母细胞内多个YAC引起交换,（3）转化效率低。,（4）难以制备纯的YAC-DNA。,结合组蛋白,（1）OriS和repE控制质粒的单向复制。 （2）parA和parB维持低水平质粒拷贝数。,2. BAC的组成结构,（3）CosN是噬菌体末端酶专一性切割位点。 （4）loxP是P1 Cre蛋白作用位点。 （5）HindIII和BamHI是插入位点。 （6）两侧的NotI可用于切下外源DNA。,（7）氯霉素抗性基因CMR,第四节 病毒载体,一、反转录病毒载体,1.反转录病

49、毒（ritrovirus）,属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。 两个相同的RNA分子在5端附近经氢键连接形成70S RNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。,反转录病毒结构,Influenza virus,HIV,类似于真核细胞mRNA,2. 反转录病毒的基因组结构,env,pol,gag,U3,U3,U5,U5,cap,polyA,3,5,LTR,LTR,R,R,+,Moloney murine leukemia virus (Moloney MLV),长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。

50、LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。,LTR：,+：组装时必需的非编码序列。 env：外壳蛋白。 pol：反转录酶和整合酶。 gag：核心蛋白。,env,pol,gag,U3,U3,U5,U5,cap,polyA,3,5,LTR,LTR,R,R,+,U5、U3：5段或3端独特序列。,3. 反转录病毒载体构建,（1）删除pol、env和gag基因。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,启动子,（2）插入标记基因（如neor）。,（3）外源基因和启动子插入到+下游。,4.反转录病毒载体的包装,反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。,用两个缺失了+的反

51、转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。,（1）包装细胞系的构建,5LTR,gag,3LTR,pol,env,3LTR,5LTR,5LTR,gag,3LTR,pol,env,3LTR,5LTR,病毒外壳蛋白,包装细胞,（2）载体RNA的包装,用载体DNA转化包装细胞系,转入的载体DNA上带有+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,高效转染靶细胞,5. 反转录病毒载体的优点,（1）将DNA插入宿主基因组的随机位点上。 （2）侵染范围广、感染率高。 （3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定， 拷贝数目较低。 （

52、4）包装的外源DNA可达10kb。 （5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主 细胞没有毒性。,反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。,二、DNA病毒载体,腺病毒（adenovirus）,1. 腺病毒的基因组,线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。 共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。,（1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。 （2）宿主范围广,2. 腺病毒的优点,不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。,（4）载体中的插入片断可达7.5kb （有包装容量限制）。 （5）腺病毒容易制备、纯化。 （6）基因组结构和功能了解得清楚。,（3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，,可以通过口服或喷雾的方式感染。,3. 腺病毒载体,是目前最常用的基因治疗载体之一。,（1）腺病毒载体的构建,用同源重组的方法插入外源基因。,删除腺病毒DNA一些非必需区,ITR,E1,ITR,E3,如E1或E3区，增加插入能力。,E1或E3缺失病毒。,含有E1或E3区两侧的同源序列。,在同源序列之间插入外源基因和选择标记基因。,构建质粒载体,把质粒切成线性,共同转染细胞,在细胞中发生同源重组，把外源DNA