二代测序技术在医学领域中的应用

1、第二代测序技术在医学领域的应用，魏东凯，概述，第二代测序技术简介NGS方案石蜡包埋样品溶液CTC和ctDNA在普通医学领域，第二代测序技术简介，人类基因组，30亿个碱基对来自母亲，30亿个碱基对来自父亲的线粒体基因组，DNA组成，末端测序，ABI 3700 (ABI 3730)，人类基因组计划，HGP)于1985年首次由美国科学家提出，并于1990年正式启动。来自美国、英国、法国、德国、日本和中国的科学家参与了人类基因组计划，预算为30亿美元。根据该计划，有必要解开人体内大约40，000个基因的所有密码，同时绘制人类基因谱。换句话说，这是为了揭开构成人体40，000个基因的30亿个碱基对的秘密

2、。人类基因组计划，连同曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划，被称为三大科学项目。被称为生命科学的“登月计划”。Celera Genomics公司的Craig Venter是第一个使用全基因组鸟枪法测序的公司，使用了330台ABI 3700计算机，购买了当时世界上排名第三的服务器，并花了三个月的时间对Venter的基因组进行测序以获得20GB的数据。文特尔基因组测序，基于分子克隆，必须将DNA片段克隆到大肠杆菌中，否则测序是不可能的。每次终止的反应系统为10ul，包含1013个DNA分子，但每次只能检测到其中一个。预计耗资2亿美元，最终将耗资30亿美元！我们如何减少试剂消耗？1.用聚合酶链式反应代替分子

3、克隆，先在DNA片段上加尾。桥接聚合酶链反应2。减少反应体积，将测序反应放入一个小空间。10ul试剂可进行更多的DNA测序反应。1.用聚合酶链式反应代替分子克隆，先在DNA片段上加尾。桥接聚合酶链反应2。减少反应体积，将测序反应放入一个小空间。10ul试剂可进行更多的DNA测序反应。桥聚合酶链反应，第二代测序(NGS)，合成时测序(SBS)，流式细胞仪，SBS技术特征，最初的阅读长度只有31bp，现在可以达到600bp。随着运行时间的延长，荧光信号将逐渐减弱。一次只能结合一个碱基，并且会发出荧光信号。海信2500可以同时运行两个8通道流动池。有两种模式：高吞吐量模式和快速模式。单次运行的数据量

4、高达500GB。快速模式的最小运行时间为17小时。NGS方案在普通医疗领域、第二代测序应用医疗的可行性，以及NGS的优势，与第一代测序相比，NGS更省时、低成本、快速、覆盖面深、准确率高；高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的未知基因；对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者和医生提供更准确的诊断依据；有许多类型的需求样本，但是对样本大小的需求很小。NGS方案在普通医学领域中，全基因组再测序(WGRS)发现个体突变，InDel，CNV，SV等。需要大量数据，单个样本需要90G数据。全外显子测序(WES)捕获基因组中的全外显子进行测序，其测序数据比WGRS少得多，并且可以获得高测序深度(

5、50X-150X)。普通医学领域的NGS方案捕获并丰富了感兴趣的测序目标区域。该技术过程与全外显子捕获相似，测序需求小于WES。转录组测序(RNA-Seq)，可获得更高的测序深度(高达500倍)，研究转录水平上的测序，包括mRNA、低分子量核糖核酸、微核糖核酸等。全基因组重排是一种对已知基因组序列的个体进行基因组测序，并分析个体或群体水平差异的方法。随着基因组测序成本的降低，人类疾病致病突变的研究已经从外显子区域扩展到全基因组。高通量测序通过构建不同长度的插入文库，结合短序列和双端测序，可以在全基因组水平上检测常见、低频率甚至罕见的突变位点和与疾病相关的结构变异，具有很大的科研和工业价值。全基

6、因组重测序(WGRS/DNA序列)，单核苷酸多态性(个体间差异)，CNV(大片段基因的拷贝数变异)，结构变异，全基因组重测序的应用，单核苷酸多态性(SNV)，例子，为什么研究单核苷酸多态性？单核苷酸多态性被认为是疾病发生的基因分子标记。单核苷酸多态性被认为是导致药物分化的主要因素之一，因此可以根据单核苷酸多态性的变化进行个性化用药。单核苷酸多态性分布广泛且相对稳定。一些单核苷酸多态性直接影响功能基因的表达。大多数单核苷酸多态性是无用的，大多数单核苷酸多态性属于沉默突变。非编码区的错义突变不会引起蛋白质变化。但也有例外。诊断示例：詹姆斯格恩博士和约瑟夫德里西博士合作从一名患有重症多动症的青少年男

7、孩的脑脊液中提取核酸样本，并测量了800万个核酸序列，其中检测到475个钩端螺旋体序列，从而判断该男孩的疾病是由钩端螺旋体感染引起的。根据上述判断，詹姆斯格伦医生用青霉素治疗了这个男孩，并治愈了他。脑脊液是一种难以获得的体液，只能收集少量，这限制了可获得的核酸总量。钩端螺旋体在病原体的共同等级中是一个较低的物种。在这种情况下，如果用聚合酶链反应逐个筛选病原体，可能找不到钩端螺旋体，核酸也不够。但是高通量测序克服了核酸不足的问题。在这种情况下，钩端螺旋体的DNA只占总DNA的0.6%，而且含量很少。然而，经过高通量测序，获得了475个钩端螺旋体脱氧核糖核酸，这使得钩端螺旋体无处可循。当H1N1病

8、毒在2009年爆发时，一名患者死于呼吸系统引起的多器官衰竭，但具体死亡原因不明。科学家利用病人肺部穿刺组织的DNA作为高通量测序。最终，950万个序列中的0.85%来自H1N1病毒基因组，这帮助科学家发现了病人死亡的真正原因。在人类基因组高度干扰的背景下，其他技术很难快速找到致病病毒的序列和分子分型。黑田东彦，男，Katano，h .Nakajima，n .Tobiume，m .Ainai，a .Sekizuka，t .Sata，T. (2010).公共科学图书馆1，5(4)，E10256。主要用于发现罕见突变。遗传突变和与癌症相关的体细胞突变可以通过单核苷酸多态性和非特异性脱氧核糖核酸进行分

9、析，但由于捕获区域较短，它们通常不用于CNV和奇异值分析。在WES应用领域，成本较低(一般为50-150倍，只需要8-15G的数据)，这减少了分析的背景，使得很容易找到罕见的突变。可以检测到大约50-80bp的片段缺失。由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断它是由捕获缺失还是缺失引起的。同样，由于捕获的芯片片段很短，CNV和奇异值分析一般不做。水环境系统特征，水环境系统方案流程，包括基因序列，基因序列，sRNA序列等。可以高通量地分析转录物信息，并且可以找到未知的转录物和基因注释。寻找个体间和同一个体不同时期感兴趣基因表达的丰度变化。转录组测序(RNA-Seq)，信使核糖核酸序列方案，一些关于非

10、编码核糖核酸的知识：非编码核糖核酸，长度超过200个碱基，具有内含子和外显子区域，可以调节基因表达，如它对染色体结构的影响，它对核糖核酸加工和稳定性的影响，它对转录和翻译的影响，甚至它对蛋白质转运和稳定性的影响。因此，近年来，许多关于核糖核酸序列测定的文章包括对低核核糖核酸的分析，并且发现了许多新的低核核糖核酸。lncrna-seq、srna-seq和rna-seq的优点不限于已知的基因组序列信息。与芯片技术相比，对未知基因组序列物种的高通量转录组研究背景信号值低，没有检测上限，基因表达谱的检测范围非常宽。在内部参考的情况下，它在定量方面显示出高的准确性和可重复性。不需要克隆步骤，操作简单，所

11、需样品量小，表达谱分析可以在单细胞水平进行，产量高，成本低于Tilling阵列或大规模EST测序。的挑战，大片段的核糖核酸必须在文库构建过程中进行片段化，这将引入一定的偏见。聚合酶链反应会引起表达水平的变化。大量短序列数据的比对或拼接非常复杂，重复序列和多个匹配序列的精确定位存在明显的问题。在高等真核生物中，选择性剪接和反式剪接的鉴定仍然存在相当大的误差。测序深度的确定因物种、器官、组织和时期而异，因此很难用统一的公式直接计算。石蜡包埋样品溶液、FFPE样品(石蜡包埋切片组织)和福尔马林固定包埋(ffpe)是临床上保存DNA最常用的方法。全世界医院中超过80%的珍贵临床样本都是通过这项技术保存

12、的。然而，在福尔马林浸泡后，DNA分子被酶交联和修饰，导致不同程度的DNA降解。样本量巨大，80%以上的临床标本通过石蜡包埋保存，许多珍贵的临床标本已经过组织病理学研究。很容易完成相关的实验验证。为什么FFPE的样本很难提取，而福尔马林处理后的DNA容易发生交联，这使得提取的DNA数量少，质量差。一般来说，200bp-5kb的降解程度与石蜡包埋时间有关。FFPE-WES的巨大挑战是它目前不能在WGRS使用，而且样品降解严重，这对DNA覆盖率有很大影响。脱氧核糖核酸的数量太少，质量很差。石蜡包埋时间越长，福尔马林对DNA的交联和损伤越大。未用保护性缓冲液处理的福尔马林影响较大。FFPE的样本仍然

13、有问题，CTCS和ctDNA，什么是CTCs？循环肿瘤细胞是从实体瘤或转移灶中释放出来的肿瘤细胞，自发地或由于诊断和治疗的操作而进入外周血液循环。肿瘤细胞是在肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，其形成被认为是肿瘤转移的必要前提。CTCs研究的重要性和CTCs研究的难度，CTCs没有明显的特异性，与其他血细胞有明显的区别，不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物。外周血中四氯化碳的数量很少，通常只有106-107个白细胞中的一个。细胞形态富集、微流控芯片、密度梯度离心、质膜：单核细胞：单核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞、上皮细胞和肿瘤细胞)Ficoll:密度梯度流体红细胞：红细胞、免疫磁珠富集法、微流控、CTCs鉴定、流式细胞仪FCM和免疫细胞化学鉴定样品中细胞的抗原性和形态特征，使富集的靶细胞保持其细胞形态和细胞活力。ICC是四氯化碳与能与显色剂结合的单克隆抗体的特异性结合。通过显色试剂显色来识别CTCs和通过分析上皮细胞或肿瘤细