2015免疫学实验方法

1、Commonly used immunological methods,Liu Kangkang ,免疫学试验方法,免疫,识别和清除抗原性异物,可能有利，也可能有害,免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力,免疫耐受,免疫应答,免疫学检测与免疫学技术,一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测-ELISA 四、免疫组织化学 五、免疫印迹技术 Western Blotting 六、 流式细胞术 七、PCR技术 八、基因沉默技术,免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。 免疫学技术的应用极为

2、广泛，疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。,一、抗原抗体的检测技术,(一)细胞计数细胞计数板 *准备细胞计数器：70%乙醇 制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化 加样 细胞计数：100倍镜下观察，“计上不计下，计左不计右”,二、免疫细胞的检测,对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定,细胞密度： 每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平均数细胞稀释比例104,1 mm20.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml,(二)免疫细胞功能的测定 1T细胞功能测定 （1）T淋巴细胞增殖试验：T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，可

3、通过以下三种方法检测。 1）形态计数法,2）3H-TdR或125I-UdR掺入法,放射性元素,wash,Stimulate,Assay,3）MTT（噻唑蓝）比色法,MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。,1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验每孔通常加入103个以上数量

4、的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予0-10微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子或细胞毒药物； 4培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育36小时； 5孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37细胞培养箱内再继续孵育，直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解

5、的时间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。,MTT实验流程,（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血、渗出，于2448小时发生，72小时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的可发生水肿，甚至坏死。,2B细胞功能测定 B细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体可以在血浆和其他体

6、液中检出，检测抗体是测定B细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激,（2）B细胞产生抗体能力的检测：,1）ELISA检测培养上清中抗体的量。 2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。 详细见后述,3细胞毒试验 细胞毒实验技术是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。,Target cell,51Cr labeled,CTL,Target cell,Cr51 release,Assay,CTL,51Cr release,（1）放射性核素释放法：(51

7、Cr、125IUdR),（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细胞活性.,（3）MTT比色分析法,4吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-）能使被吞噬进细胞内的NBT还原成不溶性蓝黑色甲臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数NBT阳性细胞

8、，可反应中性粒细胞的吞噬功能。,（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。,三、细胞因子的检测,基础: 抗原或抗体的固相化 抗原或抗体的酶标记 用途：目标蛋白的定性或定量分析,酶联免疫吸附试验-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA三个必要试剂： （1）固相的抗原或抗体， 即免疫吸附剂（immunosorbent）; （2）酶标记的抗原或抗体， 称为结合物（conjugate）； （3）酶反应的底物。,a.包被 b.抗原

9、抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。,ELISA基本的实验过程：,对照和标准曲线：,阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释,用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：,双抗体夹心法测抗原（常用） 夹心法 双抗原夹心法测抗体 间接法测抗体（常用） 竞争法测抗原 竞争法 竞争法测抗体 捕获包被法测抗体 亲和素-生物素 ELISA法,双抗体（原）夹心法测抗体,Anti-HIV, Anti-HBs,双抗体夹心法,双抗原夹心法,HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2,双抗体夹心法测抗原步骤,双抗体夹心法测抗原特

10、点,抗原浓度过高出现钩状效应（Hook effect）:所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现假阴性结果。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心 。,间接法测抗体, 间接法是检测抗体最常用的方法。 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。, 操作步骤： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤。 （2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。 （3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。 （4）加底物显

11、色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。,间接法的特点,本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗体检测相应抗体。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。,ELISPOT（酶联免疫斑点法）,方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果B细胞产生抗体，抗体与班上的抗原结合。加入二抗和显色剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。 此法的主要优点是: 稳定、特异，且抗原用量少； 与ELISA联合使用，可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定

12、量测定； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,四、免疫组织化学 Immunohistochemistry,原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶） 用途：组织或细胞内抗原的定性和定位,流程：,免疫荧光技术（immunofluorescence ，IF）,定义：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。,原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原（抗体）标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光标记物作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见

13、荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。,结果判断,设立实验对照:阳性对照和阴性对照 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型,Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1/ but not TNFR1/R2/ mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sect

14、ions were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.,TNFR1/,TNFR1/TNFRR2/,成败的关键因素： 组织的固定、包埋 抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间） 非特异性抗原的封闭 内源性酶或自发荧光的消减 显色,思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于

15、石蜡切片？,五、免疫印迹技术 Western Blotting（分子生物学实验方法）,一. 蛋白质样品的提取分离 二. 蛋白质样品的定量 三. 制备SDSPAGE胶 四. 转移电泳及免疫印迹 五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件 imageJ或Quantity One,免疫学三大工具比较,免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿

16、液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。,免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度非常高。 Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。,ELISA与Western Blotting比较,WB可以看到特异性的条

17、带，但是定量比较麻烦； ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信； WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到； WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测； WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力； WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。,免疫共沉淀（Co-IP),用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其

18、他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。,六、流式细胞术 (Flow Cytometric analysis),Beckman FC500流式细胞仪,测量对象大小: 悬浮在溶液中的相互离散颗粒 大小范围：0.2m - 300 m 高等真核细胞,FCM的应用特点: （1）多参数定量分析每一个细胞； （2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群、 单细胞克隆等。 （3）高通量（分析分选） 分析150,000个/ 秒 分选100,000个/秒,FCM的应用,1、免疫功能研究 2、膜表面抗原和胞浆内蛋白分析 3、DNA含量及细

19、胞周期分析 4、定量分析 5、细胞功能分析 6、凋亡研究 7、细胞间相互左右 8、细胞分选,FCM的主要测定指标,FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4 其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪数据分析,SSC,FSC,可以通过设“门” (Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。,数据的存贮、显示和分析,目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物最多可达4个，数据的存贮采用列表排队方式，可节省存贮空间。 数据的显示常用以下几种方式： 散点图 直方图 等高线图 密度图 三维图,散点图(Dot Plot)

20、 X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。,直方图(Distribution Histogram) 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是道数，可以是线性或对数坐标。 纵坐标一般是细胞数。,FCM标记方法,单标（一种单抗/tube）： FL1, FSC, SSC（三参数） 双标（两种单抗/tube）： FL1, FL2, FSC, SSC（四参数） 三/四标（三种单抗/tube或四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC,荧光抗体的选择,首选直接标记抗体 荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原

21、PerCP APC FITC PE 间接标记：适用范围广，biotin-avidin不适合 弱抗原的检测,实验对照的设计,空白对照：ALL（样本） 阴性对照：常用同型抗体对照（同型+样本） 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） 阳性对照：在实验过程中如涉及到表达缺失或减少的实验，应设置阳性对照组，其设置方法与阴性对照设置相同,FCM样品来源,需要制备细胞悬液 血液、体液等液体样品 培养的细胞 活体组织样品 冰冻组织 固定的组织样品,直接应用 分离后使用,七、RT-PCR实验方法,是指对组织或细胞的总RNA进行抽提，把RNA反转录为cDNA，然后设计目的基因引

22、物进行PCR，琼脂糖电泳并数码拍照，分析电泳条带灰度值，判断目的基因mRNA转录水平的相对量的变化。,RT-PCR流程简介,一、抽提RNA,1、防止RNA酶污染 180的高温下干烤6hr以上； 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗； 去污剂洗涤，双蒸水冲洗； 溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂应为新开封或RNA专用； 操作人员戴手套； 器械专用。,2、材料的准备 组织及细胞最好为新鲜的，或者在70条件下保存半年以下； 尽量避免材料的冻融 。,3、确认RNA的质量 检测RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.82.0 RNA的电泳图谱： 28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰

23、，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。,二、反转录,单管一步法 反转录和PCR反应在一个管子中完成 ，得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩增 ，灵敏度更高，但是容易相互干扰 。 两步法 反转录和PCR分开做，PCR取反转录反应产物的1/10进行，更为灵活而且严谨，但是灵敏度不如前者高。,三、PCR,1、参照基因 PCR 参照基因一般选择看家基因（长表达、高表达量的基因），常用18S、actin、bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍； 2、目的基因 PCR 典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。,61,RNA 干扰 (RNA interference, RNAi):由小双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 小干扰RNA: 具有干扰功能的这种短双链RNA就称为小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA)。,基本概念,八、基因沉默原理与技术,62,靶,RNAi 机制,siRNA在ATP参与下形成RNA诱导沉默复合物（RISC），被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中的反义链指导移至靶mRNA，靶mRNA被切割后诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。,外源长dsRNA在ATP作用下被RNase Dicer切割成21nt左右