survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究.ppt

1、皖 南 医 学 院,硕 士 学 位 论 文 答 辩 会,survivin反义寡核苷酸诱导白血病细胞凋亡的研究,The effect of survivin antisense oligonucleotide on apoptosis of HL-60 cells,前 言,1997年耶鲁大学的Altieri博士用EPR-1的cDNA在人类基因组库的杂交筛选实验中发现了一段15kb大小的基因片段，它编码了142个氨基酸组成的Survivin蛋白；Survivin的编码基因位于染色体17q25，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成员,Structure of human IAP protein fam

2、ily,17q25,BIR: baculoviral IAP repeat,RZF: ring zinc-fingle,CARD: caspase recruitment domain,Inhibitor of Apoptosis,Location in human chromosome,Survivin分子结构,长螺旋,BIR区,Survivin分子结构,长螺旋,BIR区,Survivin分子结构,Survivin形成二聚体,Survivin表达,肺癌,肝癌,膀胱癌,皮肤癌,神经母细胞瘤,乳腺癌,食管癌,胃癌,白血病,Survivin表达,SURVIVIN选择性表达于绝大多数肿瘤组织 在正常

3、成人分化组织中不表达（包括癌旁组织）,普遍性,独特性,Survivin作用,!,Survivin作用,Survivin 抗凋亡,肿瘤细胞,分裂增加凋亡减少,研究内容,反义Survivin,survivin表达受抑,活化,细胞凋亡,技术路线,HL-60细胞体外悬浮培养,掺入反义寡核苷酸,48 h 后,分别于24h、48 h形态学观察、死活细胞计数,收获细胞、检测指标,RT-PCR,TUNEL,FCM,材料,细胞株 HL-60细胞株（急性早幼粒细胞系）由中国科学院上海细胞所提供,RNAgents Total RNA Isolation System Promega公司 AccessQuickTM

4、RT-PCR System Promega公司 Propidum Iodide (PI,碘化丙啶) Sigma公司,主要药品与试剂,材料,研究方法,反义寡核苷酸的序列,survivin反义硫代寡聚脱氧核苷酸(Aspo )序列 5GGCAACGTCGGGGCACCCAT39 非特异性对照硫代寡聚脱氧核苷酸(Nspo)序列 5GCCATCGTAGGGGATCGCTT39 上海SANGON公司合成与纯化,培养箱,20%新生小牛血清,RPMI-1640液,100U/ml青霉素 100 ug/ml 链霉素,37oC 5%CO2 饱和湿度,倒置显微镜观察,23天传代一次,细胞系的培养和传代,HL-60 细

5、胞,Photo1.HL-60 cells（100）,Tab1.The experiment grouping,group factor concentration Control RPMI-1640 mixture Nspo Nspo 15.0umol/L Aspo5.0 Aspo 5.0umol/L Aspo10.0 Aspo 10.0umol/L Aspo15.0 Aspo 15.0umol/L,实验分组及寡核苷酸的掺入,1000r/min 离心5min,RPMI-1640洗 1次,细胞起始浓度4106/ml,取细胞悬液1000ul接种至24孔板,核酸100 ul,置CO2培养箱中孵育,H

6、L-60细胞,细胞增殖能力及活力观察,HL-60细胞,于24、48h,取50 ul细胞悬液,0.4%台盼蓝染色,计数死活细胞,着色为死细胞拒染为活细胞,计算细胞存活率,细胞增殖能力及活力观察,HL-60细胞survivin mRNA的表达,总RNA的提取,细胞 沉淀,加入300 ul D液,加入30 ul Sodium Acetate,加入苯酚:氯仿:异戊醇300 ul,冰浴 15min 10000g4离心20min,转移上清,加入等量异丙醇,20放置10min,10000g4离心10min,75%冷乙醇洗涤RNA,10000g4离心10min,以无RNase的纯水溶解沉淀,RNA纯度检验和定

7、量,RNA,HL-60细胞survivin mRNA的表达,RT-PCR,反应体系50l,48延伸45min,95预变性 2 min,PCR循环,95 45sec 61 1 min 72 1min共30个循环,72延伸 5min,模板RNA 1 ul AMV逆转录酶 1 ul 上游引物 3 ul 下游引物 3 ul AccessQuickTM Master Mix 25 ul,Tdt 酶介导的缺口末端标记法,具体操作按试剂盒说明书进行 结果与判定：细胞核为棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞 凋亡细胞指数=,凋亡细胞数,细胞总数, 100%,DNA倍体分析及凋亡率的检测,实验流程,单细胞悬液,不含C

8、a2+或Mg2+的PBS洗细胞 2次,1000g离心5min弃上清,计数细胞总数,500l PBS重悬,5ml冷乙醇,4过夜,离心洗细胞2次,含1%小牛血 清的800l PBS重悬,避光孵育1h,100l煮沸过的RNA酶A,37 30分钟,FCM分析,加入100l PI,统计分析,结果均以“均数标准差”表示，组间比较用单因素方差分析，以P0.05确定有显著性意义。,结果(1),细胞增殖能力及活力观察,Tab2. Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate (xs, n=3),* p0.05, * p0.01 vs Ccontrol, p0.05, p

9、0.01 vs Nspo,Group Survival rate (%) 24 h 48h Control 98.70 0.70 98.28 0.45 Nspo 98.59 0.60 97.47 0.47 Aspo5.0 96.77 0.47* 95.05 0.24* Aspo10.0 92.63 1.16* 89.08 1.20* Aspo15.0 82.61 0.85* 77.71 0.77*,Fig1. Effect of Aspo on HL-60 cells survival rate (xs),结果(2),TUNEL法检测的HL-60凋亡细胞及其凋亡指数,Photo2.contro

10、l group (DAB400),Photo3.Nspo group(DAB400),Photo4.Aspo5.0 group (DAB400),Photo5.Aspo10.0 group(DAB400),Photo6.Aspo15.0 group(DAB400),GroupApoptotic index(%) P C N Control 2.16 0.29 Nspo 2.21 0.25 Aspo 5.0 4.77 0.42 * Aspo10.0 10.63 0.99 * Aspo15.0 21.67 1.95 * ,* p0.05, * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0

11、.01 vs Nspo,Tab3.Apoptosis index of HL-60cells (xs,n=3 ),结果(3),Aspo处理HL-60细胞survivinmRNA表达的变化,Fig2. survivin mRNA expression of HL-60 cells treated by Aspo for 48 hours detected by RT-PCR,1:100 bp DNA ladder ; 2:Control; 3: Nspo group; 4:Aspo5.0 group ; 5: Aspo 10.0 group ;6 :Aspo 15.0 group.,Tab4.e

12、ffect of Aspo on survivin mRNA expression of HL-60 cells (xs,n=3 ),* p0.05, * * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0.01 vs Nspo,Group,survivin/-actin,P,C N,C Nspo Aspo5.0 Aspo10.0 Aspo15.0,0.8120.006 0.8180.005 0.7800.005 0.5980.008 0.4960.012, ,* * * * * *,结果(4),流式细胞仪凋亡率的检测,Tab.5 Effect of different doses o

13、f Aspo on HL-60 cells apoptosis (xs,n=3 ),* p0.05, * * p0.01 vs Ccontrol；p0.05, p0.01 vs Nspo,Group,Apoptosis rate(%),P,C N,C Nspo Aspo5.0 Aspo10.0 Aspo15.0,1.090.49 1.620.34 2.670.56 5.750.90 19.800.30, ,* * * * * *,Fig.5 Apoptosis peak measured by flow cytometry of HL-60 treated with survivin Aspo

14、,A:control B: survivin Nspo C: survivin Aspo,讨 论,细胞凋亡机制的研究进展：,细胞凋亡:又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,由Caspases（即含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶）家族成员介导的蛋白酶级联反应过程,凋亡机制,凋亡提呈:驱动性Caspases 凋亡实施:效应性Caspases,凋亡机制,Survivin与白血病的关系,Survivin在各种白血病中均有表达，随着病情的缓解survivin表达也降低。且有研究发现survivin低表达的白血病患者，其完全缓解率及存活率高，而 survivin高表达患

15、者不易缓解，且易复发 survivin mRNA表达与白血病诊断、治疗转归及预后判断密切相关,急性早幼粒细胞白血病的简介,白血病是常见的恶性肿瘤之一，发病率2.7610万。 在恶性肿瘤的死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则居第 1 位 26 急性早幼粒细胞白血病（APL）的构成比约占急性白血病的1015% 其临床特征之一是严重出血，因此早期病死率高。,急性早幼粒细胞白血病的治疗现状,联合化疗： 缓解率可达6080% 非特异性细胞毒性，抑制患者造血功能和免疫功能 其毒副作用不但造成患者治疗的相关性死亡，而且影响其“治愈”剂量的临床应用。此外，由于白血病细胞

16、对化疗药物的耐药，多数病人最终复发。,随着分子生物学技术的发展和对白血病发生、发展分子机理认识的深入，使白血病的研究进入了基因治疗新阶段。,Survivin 作为靶基因的思考,作为白血病反义治疗的理想靶基因必须具备以下两个条件： 在肿瘤发生过程中起关键作用； 只有在肿瘤中表达，而在正常组织中不表达。 survivin基因治疗具有良好的靶向性、特异性及安全性 Survivin作用于细胞凋亡中的关键酶 -Caspase-3 Survivin表达的普遍性和独特性,细胞凋亡诱导物,病毒感染 射线 DNA损伤,死亡信号,survivin,活化Caspase-3,细胞凋亡,Caspase-3是细胞凋亡蛋白

17、酶级联反应的必经之路，是细胞凋亡中的关键酶，而本试验所选取的survivin基因能直接或间接抑制Caspase-3的活化，所以具有强大的抗凋亡作用 由于survivin抑制细胞凋亡的功能活性在肿瘤的发生、发展中起关键性作用，survivin在白血病细胞的重新表达可能是促成白血病发生的重要因素，survivin 可能是一种新的癌基因,反义核酸序列的选定,针对survivin基因的翻译起始密码子和前几位编码序列设计并合成的 磷酸二酯键受核酸酶作用，容易被降解，虽能用病毒载体将其转入细胞内，但考虑到安全性和临床的应用，采取的是对磷酸二酯键的磷原子进行硫代修饰，硫代磷酸寡核苷酸有好的溶解性、杂交性和稳

18、定性，并能诱导 RnaseH,survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用,凋亡特征 TUNEL法能在3，-OH末端通过产生很强的颜色反应（棕褐色）准确定位凋亡的细胞；特异性高，敏感性强，可量化凋亡细胞。细胞凋亡时染色体断裂，DNA被裂解，细胞膜通透性增加，在细胞洗染过程中，DNA碎片逸出，胞内DNA含量明显降低，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，即凋亡峰。,凋亡的DNA断裂,特征性变化是内源性核酸酶的激活将DNA双螺旋结构由核小体间连接区断裂，形成以180210bp或其多聚体组成的寡核苷酸片断，从而产生3，-OH末端。,经Aspo处理后的HL-60细胞经TUNEL染色均可见到阳性凋亡细胞，DNA组方图上在G1/G0峰前出现了特征性的亚二倍体峰，表明survivin Aspo能够特异性诱导HL-60细胞的凋亡, RT-PCR实验显示本实验所选取的这段反义核酸特异性的抑制survivin基因的表达，提示可能由于降低了HL-60细胞内survivin mRNA的含量 ，从而诱导HL-60细胞的凋亡,survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用,survivin对HL-60细胞的凋亡诱导作用,台盼兰拒染试验、TUNEL凋亡指数的分析与流式细胞术所检测出的细胞凋亡率均提示Aspo浓度的不同，所导致的细胞凋亡程度亦有不同,