植物组织培养设备及条件.ppt

1、第二章 实验室设计和培养条件,第一节 实验室设计及基本技术 第二节 植物组织培养所要求的环境条件,第一节 实验室设计及基本技术,一、实验室组成 二、仪器设备 三、培养器皿及实验用具 四、洗涤技术 五、灭菌技术 六、无菌操作,组织培养实验室布局的总体要求 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察,一、实验室组成,基本实验室,辅助实验室,实验室组成,准备室 缓冲室 无菌操作室 培养室,细胞生物学实验室 温 室 生化分析实验室,组织培养准备实验室,准备室,缓 冲 室,无 菌 室,无 菌 室,培 养 室,培养架,培养间,二、仪器设备,1）、基本仪器设备 冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解

2、剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。,冰箱,酸度计,电炉,天平,纯水器,培养基分装器,搅拌器,摇 床,体式显微镜 倒置显微镜 冷光源 电磁搅拌器 摇床,2）、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。,蒸汽压力灭菌锅,高 压 灭 菌 器,干热消毒柜,75%酒精喷雾器,喷雾消毒器,3）、无菌操作设备,超净工作台,二、设备、仪器,超净工作台,（一）设备,1.紫外线灭菌灯 2.日光灯 3.工作台 4.凳子 5.搁物架 6.窗 7.推拉门 8.缓冲间,无菌接种箱,4、细胞培养设备,摇 床,培养架,HZC-250恒温振荡培养箱,150C250D光照培

3、养箱,光照培养箱,烘箱,5、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜,倒置显微镜,光学显微镜,电子天平 （0.0001g， 0.001g）,酸度计,1、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,2、金属材质用具,镊子,解剖刀,接种针,（二）各类器皿 1器皿的类型 （1）培养器皿 三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、试管、L形管和T形管 （2）分注器 （3）刻度移液管 （4）微量移液器 （5）细菌过滤器,（三）器械用具 打孔器 镊子 解剖刀 接种针 剪刀 电热灭菌器,四、洗涤技术,2、塑料用品洗涤,3、金属用品洗涤,热洗衣粉水洗净,冲洗,擦干,五、灭菌技术,物理方法： 干热、湿

4、热、射线处理、过滤除菌等 化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌,1、灭菌方法,2、灭菌,（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法 压力在0.1M0.2MPa 温度在121 灭菌1030min （2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌,饱和蒸汽压力与其对应的温度,（3）塑料器皿灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌 （4）金属用具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用,（5）接种室灭菌,空气消毒灭菌,接种室,超净工作台,紫外灯照射,70%75%的酒精擦洗,培养材料的接种,紫外灯照射,（6）外植体灭菌,流水冲洗1020min或更长时间,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2

5、%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸馏水冲洗45次,在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右,备用,常用消毒剂消毒灭菌比较表,消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。 打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。 开启过滤风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。 用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。,（7）接种准备,六、无菌操作,实验员消毒,实验室、无菌台灭菌,实验器材的灭菌,无菌接种,消 毒,实验台卫生,培养室培养,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 准备室：器具的

6、洗涤、干燥、保存、灭菌，各种药品的储备、称量、溶解、配制、培养基分装等，设备：药品柜、防尘厨、冰箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱。 实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。化学室/准备室、接种室、培养室。,小 结,接种室：植物材料的消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、原生质体制备及其它需要进行的无菌操作。设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针）。清洁和消毒，减少与外界空气对流，穿实验服及换鞋以减少带入杂菌。 培养室：墙壁要求绝热防火的性能，培养架由金属制成，底层离地高约10cm，层间隔40cm，总高1.7m左右，长度根据日光

7、灯的长度而设计，宽度为60cm。,第二节 植物组织培养所需的环境 条件及营养成分,一、环境条件,与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同培养基组成、pH值、渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。,温度在20-27左右，空调控温，湿度恒定，相对湿度在70-80%，光照由定时开关控制，每天光照10-16h左右，不同植物决定光照时间，培养室可采用太阳光为能源，易成活，阴雨天用室内灯光补光。,二、营养成分,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内

8、起到一定的生理作用： a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢； c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡点等化学方面的作用； d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。,Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准:,A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史; B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复; C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的变化而产生的间接效果。,国内外公认

9、的高等植物所必需的营养元素有16（17）种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni） 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,根据植物体内含量多少，可把这些元素分为 大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种 微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg， Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种,按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素,1、大量元素 N是蛋白质、酶

10、、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4 、NaH2PO4等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用； S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。 Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素 在微量元素中，铁的使用最大： 一些氧化酶的组成成分 叶绿素形成的必要条件 使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,硼与蛋白质合成、糖类运输

11、有着密切的关系 铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光合作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,组织培养的条件 营养条件（培养基），组织培养的重要基质，不同植物的组织对营养有不同的要求，合适培养基才能成功。 MS培养基：1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞设计，无机盐浓度较高，硝酸盐含量高，用于植物器官、花药、细胞的组培，有些培养基是由它演变而来。 B5培养基：1968年由Galmborg为培养大豆根细胞设计，含有较低的铵盐，适合双子叶植物、木本植物,White培养基：194

12、3年由White为培养番茄根尖设计，MgSO4、硼盐浓度高，无机盐浓度低，适于生根培养。 N6培养基：1974年由朱至清为禾谷类花药培养而设计，KNO3和（NH4）2SO4浓度高，适于花药培养。 KM-8P培养基：1974年为原生质体培养而设计，有机成分复杂，包括了所有的单糖及维生素，适于原生质体融合培养。,培养基成分主要是水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中的凝胶 无机盐：大量元素（大于0.5mmol/L的元素）、微量元素。 N：是蛋白、维生素、核酸、磷脂等的组成成分，培养基中有NO3-、NH4+供应形式，如KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4等。 P：磷脂、ATP等的组成成分，常

13、用的有KH2PO4、NaH2PO4等 K：与糖类合成、蛋白代谢有关，常以KCL、KNO3在培养基中提供 Mg、S、Ca：是叶绿素、酶、细胞壁的组成成分，MgSO47H2O、CaCL2 7H2O,微量元素：小于0.5mmol/L，Fe、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等；FeSO47H2O与Na2-EDTA配成铁盐溶液。 碳水化合物：常用的是蔗糖、葡萄糖，常用浓度为3%。 维生素：以辅酶的形式参与多种代谢，对生长、分化有促进作用，VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB12、VPP（烟酸）、VC（抗坏血酸）、生物素、叶酸。 肌醇：环己六醇，参与细胞壁、细胞膜构建，100mg/L,氨基酸-

14、有机氮源，细胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，10-1000mg/L 天然复合物-椰子乳、香蕉、马铃薯滤液、酵母提取液、麦芽提取液、番茄汁等，不易培养时使用。 植物激素-培养基的关键物质，生长素类（IAA、NAA、IBA、2,4-D；细胞分裂素（6-BA、KT、ZT）；赤霉素（GA3） 生长素/细胞分裂素：高利于根、愈伤组织形成；适中利于根、芽分化；低利于芽的形成,培养基的支持物琼脂（固体培养时的固化剂，低于40度为凝胶，6-10g/L），玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是降低培养材料产生的有害物影响 抗生素-卡那霉素、头孢、青霉素、链霉素、

15、庆大霉素等，5-20mg/L，防止菌类污染。 活性炭-吸附培养基中的杂质、酚、醌类、灭菌副产物等，0.5-10g/L,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,缺铜症状： 新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点，扩大变成深褐色，引起落叶。 枝顶端生长不良，下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,缺锰症状： 叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,梨缺锰症,缺钼症状： 叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。 十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,缺硼症状： 受精不良，籽粒减少 ，“花而不实”， “蕾而不花”； 根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状； 常引起各种腐烂病。,马铃薯,缺锌症状： 小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或