基因工程06.5.ppt

1、基因工程，内容，重组DNA技术，DNA重组技术，重组DNA技术的发展历史，孟德尔1944年的豌豆杂交实验，埃弗里1973年的肺炎球菌转化实验，美国斯坦福大学的科学家构建了第一个重组DNA分子，1977年，博伊尔和斯旺森在美国南旧金山成立了世界上第一个基因工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年，第一家利用重组脱氧核糖核酸技术生产胰岛素的工厂开始建造。1997年，英国罗琳研究所成功克隆了多莉，克隆工具酶基因载体的基本原理，重组脱氧核糖核酸技术与医学的关系，本节的主要内容，首先，重组脱氧核糖核酸技术的相关概念，克隆同一份拷贝或从同一祖先收集的拷贝。获得相同拷贝的过程称为克隆

2、，即无性繁殖。(1) DNA克隆，技术层面：分子克隆是指DNA克隆、细胞克隆、个体克隆(动物或植物)，DNA克隆使用酶学。在体外，将各种来源的遗传物质(同源或异源、原核或真核、天然或人工DNA)和载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子复制子，然后通过转化或转染宿主细胞筛选出含有靶基因的转化体细胞，然后通过扩增和提取获得大量相同的DNA分子，也称为基因克隆DNA(重组DNA)。生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的是分离和获得感兴趣的基因或DNA，以获得感兴趣的基因的表达产物(蛋白质)。基因工程中用于实现基因克隆的方法和相关工作称为基因工程，也称为重组脱氧核糖核酸技术

3、。(2)工具酶，限制性内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶Taq DNA聚合酶，重组DNA技术中常用的工具酶，限制性内切酶，定义为限制性内切酶(Re)是一种识别DNA特定序列并在识别位点或其周围切割双链DNA的内切酶。Bam H与甲基化酶一起构成了细菌的限制性修饰系统，它限制外源DNA并保护其自身DNA。分类，(常用于基因工程技术中)，第一个字母取自产生酶的细菌的名称，它是大写的；第二个和第三个字母是细菌的名字，小写；第四个字母代表植物；用罗马数字表示发现的顺序。命名为，hin d，流感嗜血杆菌d株的第三种酶，具有类酶识别序列回文的特点，切口：平端切口，粘端切口，ba

4、mh，hind，平端切口，粘端切口，具有不同同工酶的限制性内切酶可以识别，有些限制性内切酶具有不同的识别序列Bam H，Bst切割DNA后，它们产生相同的粘端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为相容末端。(3)目的基因，即cDNA(互补的脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸)，(4)基因载体，它被定义为一些用于携带目的基因的脱氧核糖核酸分子，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质。常用载体质粒脱氧核糖核酸噬菌体脱氧核糖核酸病毒脱氧核糖核酸克隆载体(克隆载体)专门设计用于扩增插入的外源脱氧核糖核酸序列的载体称为克隆载体。表达载体专门为将插入的外源基因序列转录和翻译成多肽链而设计的载体称为表达载体。载体

5、的选择标准，可以独立复制；它有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点(外源DNA插入点)，通常有多个单酶消化位点，称为多个克隆位点；分子量很小，可以容纳更大的外源基因。1.质粒，可在宿主细胞中独立复制；有了一些遗传信息，它会给宿主细胞一些遗传特征。内容：噬菌体基因修饰系统gt系列(插入型，适用于cDNA克隆)EMBL系列(置换型，适用于基因组克隆)，2。噬菌体)，M13噬菌体DNA修饰系统(包括lacZ基因)M13mp系列pUC系列，3。粘粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、动物病毒DNA转化载体(如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒)等，第二，重组DNA技

6、术的基本原理，以质粒为载体的DNA克隆，内容，(1)目的基因的获得，1 .化学合成方法要求目标基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列是已知的。2.基因组文库)3。cDNA文库4。聚合酶链式反应(PCR)，*通过化学合成获得目标基因，从已知氨基酸序列推断可能的DNA序列，组织或细胞的染色体DNA，基因片段，克隆载体，重组DNA分子，含有重组分子的转化细菌，限制性内切酶，受体细菌，转化细胞中存在的基因组DNA文库，由克隆载体携带的所有基因组DNA的集合，*从基因组DNA文库获得目标基因，体内DNA的复制。，5，5，3，3，(3)外源基因与载体的连接，1。内聚性末端连接方式：(1)与相同限制性位点的连

7、接(1) T4 DNA连接酶15C、相同限制性位点的连接、内容、不同限制性位点的连接(不相容端)、Eco R切割位点、Bg l切割位点和相容端与相同限制性位点的连接相似。目录，2。平端连接适用于：将限制性内切酶切割产生的平端粘性端填充或平切形成平端。均聚物尾连接是在末端转移酶的作用下进行的，在DNA片段的末端加入均聚物序列使其成为粘端，然后进行粘端连接。载体DNA、目标基因、限制性内切酶或机械切割、限制性内切酶、内容物、4。人工接头是通过在平端增加一个新的酶切位点，然后用限制性酶切掉产生粘端，从而进行粘端连接。、人工接头及其应用、内容、限制性内切酶和重组酶对宿主菌的限制在于感受态、转化、转染和

8、感染的导入方式，(4)将重组DNA导入受体菌，(5)重组1的筛选。直接选择法(1)耐药性标记选择(2)标记拯救(3)分子杂交原位杂交的Southern印迹(2)免疫化学和酶免疫分析等免疫学方法。(插入失活法)耐药性标记选择、目录、组氨酸缺乏的大肠杆菌、关键词无组氨酸培养基、酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因、促进组氨酸合成、脱氧核糖核酸、重组、标记修复、重组脱氧核糖核酸技术的操作过程可以直观地概括为：小结、重组脱氧核糖核酸技术操作的主要步骤、内容、表达系统的建立、表达载体的建立、受体细胞的建立、表达产物的分离和纯化、(6)表达原核表达系统(大肠杆菌表达系统是最常用的)标准：选择具有强启动子翻译控制序列

9、的多接头克隆位点。大肠杆菌表达系统不适合表达不能被真核基因组DNA加工和表达的真核蛋白质。表达的蛋白质往往形成不溶性包涵体，难以表达大量的可溶性蛋白质。大鼠胰岛素原基因的表达和分泌、内容、优点：表达克隆的基因和真核基因组能适当修饰表达的蛋白表达产物。缺点：操作技术困难、耗时且经济，通过转染将表达载体导入真核细胞的过程，方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导的转染电穿孔脂质体转染显微注射，2。真核表达系统的物理图谱酵母、昆虫、哺乳动物细胞、表达载体pFASTBACI、(1)疾病基因的发现和克隆根据基因定位和克隆并研究其性质，可以了解疾病的分子机制。重组技术与医学的关系(2)生物制药和重组脱氧核糖核酸药物产品、内容、遗传诊断是利用分子生物学和分子遗传学的技术和原理，在脱氧核糖核酸水平上分析和鉴定基因替换、缺失或插入等突变。(3)基因诊断、基本过程、识别或鉴定DNA异常、分离和扩增待检测的DNA片段以及能够正确扩增靶基因的标准；能够准确区分单个碱基的差异；低背景或