重组技术的基本工具和基本操作程序

1、专题一基因工程,基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。（P1）,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基因工程的概念,一、 DNA 重组技术的基本工具,“分子手术刀” ,“分子缝合针” ,“分子运输车” ,限制酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.分布：,2.特点：,专一性，即

2、能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使之断开。,主要从原核生物中分离纯化出来的一类酶。,G A A T T C,C T T A A G,G,C T T A A,G,A A T T C,C C C G G G,G G G C C C,C C C,G G G,G G G,C C C, ,中轴线, ,EcoR （在G与A之间切割）,Sma （在G与C之间切割）,粘性末端,平末端,在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端； 在识别序列中轴线处切割，产生平末端。,3. 结果：,思考,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几

3、个黏性末端？,两个切口， 四个黏性末端。,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,2.连接酶的部位：,磷酸二酯键，不是氢键,1.连接酶的作用：,将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,3.连接酶的类型（按来源分类）,(1)E.coli DNA连接酶： (来源于大肠杆菌),只能连接双链DNA片段互补的粘性末端,(2) T4 DNA连接酶： （来源于T4噬菌体）,既可以连接双链DNA片段 互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端 之间的效率比较低。,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和

4、不同点？,双链,单链,在两DNA片段之间形 成磷酸二酯键,将单个核苷酸加 到已存在的核酸 片段上，形成磷 酸二酯键,都能形成磷酸二酯键,（三）基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.作用：,2.条件： 能在宿主细胞内复制并稳定地保存； 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入； 具有标记基因，便于筛选； 必需是安全的，对宿主细胞无害。,将外源基因送入受体细胞,3.种类：,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等,质粒 细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子,在进行基因工程操作中， 真正被用作载体的质粒， 都是在天然质粒的基础 上进行过人工改造的。,二、基因工程的基本操作程序,目的基因的

5、获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,（一）目的基因的获取,1、目的基因主要是指_，也 可以是一些具有调控作用的因子。,编码蛋白质的基因,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,（1）从基因文库中获取目的基因,（2）利用PCR技术扩增目的基因,（3）人工合成目的基因,原核细胞的基因结构,原核细胞基因,编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质,非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等,真核细胞的基因结构,真核细胞基

6、因,编码区 （间隔、不连续）,外显子：能编码蛋白质的DNA序列 内含子：不能编码蛋白质的DNA序列,非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子,基因文库的构建,基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接 导入受体菌群,该生物 cDNA文库,1.下列关于基因工程中限制酶的描述，错误的是（ ） A.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B

7、.限制酶的活性受温度的影响 C.限制酶能识别和切割RNA D.限制酶可从原核生物中提取,C,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （ ） A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,3、下列关于限制酶的说法正确的是（ ） A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少 B、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 C、不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端 D、限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,B,4.下图为DNA分子结构示意图，对该图的正确描述是 A的名称是胞嘧啶脱氧核苷酸 B解旋酶作用的部位是 C某限制性核酸内切酶可选择处作为切点 DDNA连接酶可连

8、接处断裂的化学键,BD, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_ 、 _ .,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA双链复制,模板DNA,四种脱氧核苷酸,DNA引物,热稳定DNA聚合酶,利用PCR扩增目的基因, 过程,高温变性(DNA解旋)（9095）,低温退火(引物结合)（5560）,中温延伸(互补链合成)（7075）,双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。,多次重复, 特点：指数形式扩增,目的基因的mRNA,单链DNA,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA

9、的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）化学合成法:,人工合成：,质粒,目的基因,限制酶,（二）基因表达载体的构建核心,1.构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,2.构建零件及其作用,（1）目的基因,（2）启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,（二）基因表达载体的构建核心,（3）终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,（4）标记基因 鉴别受体细胞中是否

10、含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,2.构建零件及其作用,(5) 复制原点,（二）基因表达载体的构建核心,（三）将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。,导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。,（1）农杆菌转化法,1.导入植物细胞,（2）其他方法,基因枪法 花粉管通道法,移 植,显微 注射,分裂 分化,发 育,2.导入动物细胞,(显微注射技术),含目的基因的表达载体,动 物 的 受 精 卵,含目的基因的受精卵,早

11、期 胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动 物,3.导入微生物细胞,(2)优点,(3)常用受体细胞,(1)过程,制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。,重组DNA分子与感受态细胞混合，完成转化。,(Ca2+ 处理法),繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。,大肠杆菌（E.coli）,（四）目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质

12、。下列叙述 不正确的是 （ ） A.常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒 B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 C.DNA连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C,2.科学家常选用的细菌质粒往往带有一个抗菌素抗性基 因，该抗性基因的主要作用是（ ） A、提高受体细胞在自然环境中的耐热性 B、有利于检测目的基因是否导入受体细胞 C、增加质粒分子的相对分子质量 D、便于与外源基因连接,B,3.下图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步需用到的工具是（ ）,A、DNA连接酶和解旋酶 B、DNA聚合酶和限制性核酸

13、内切酶 C、限制性核酸内切酶和DNA连接酶 D、DNA聚合酶和RNA聚合酶,C,4下列有关基因工程技术的正确叙述是（ ） A重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快 D只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达,C,5.科学家运用基因工程技术将人胰岛素基因与大肠杆菌的 质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达。 胰岛素基因与大肠杆菌质粒DNA彼此能结合的依据是（ ） A基因自由组合定律B半保留复制原则 C基因分离定律 D 碱基互补配对原则,D,6.2003年在中国大地上最惨烈的事

14、件就是“非典”侵袭、 肆虐着人体的健康，夺取了许多人宝贵的生命。医院人 满为患，“非典”与“发热”、“疑似”混杂在一起，让医生 难以区分。我国科学工作者日夜奋战，利用基因工程迅 速研制出“非典”诊断盒。其作用机理是 （ ） A治疗“非典”利用的是抗原抗体反应 B诊断“非典”利用的是DNA分子杂交原理 C诊断“非典”利用的是抗原抗体反应 D治疗“非典”利用的是DNA分子杂交原理,B,7.天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题： 将淀粉

15、酶基因切割下来所用的工具是_， 用_将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子， 下一步将该DNA分子_，以完成工程菌的构建。 若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检 测方法是_；若要检测淀粉酶基因是否翻译成 淀粉酶，可采用_检测。,限制酶,DNA连接酶,导入酵母菌,DNA分子杂交,抗原一抗体杂交,8多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的 技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95下使模 板DNA变性、解链55下复性（引物与DNA模板链结合） 72下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列 有关PCR过程的叙述中不正确的是（ ） A变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对

16、之间的氢键，也 可利用解旋酶实现 B复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配 对原则完成 C延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸 DPCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高,C,含重组质粒土壤农杆菌,A 构建,土壤农杆菌,导入,B 培养选择,侵 染,9.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。,请据图回答： （1）A过程需要的酶有_。 （2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是 _。 （3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加 入_。 （4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用 _ _ _作为探针。,限制酶和DNA连接酶,具有标记基因；能在宿主细胞内复制并稳定保存,卡那霉素,