第一章 核酸的制备2.ppt

1、,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段。 优点： （1）便于分离; （2）便于检测; （3）便于回收。,第四节 核酸样品的分析与检测,一、核酸样品的凝胶电泳分析 (一)凝胶电泳检测核酸的基本原理 核酸分子在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电泳过程中，核酸分子从负极向正极移动，并按核酸构型和分子大小分离开。电泳后用染料染色。 由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数。 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核

2、酸分子。 琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳,（二）琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10500 bp）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。,琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒

3、定的电场下电泳。,(1)凝胶缓冲液和电泳缓冲液 TBE,TAE TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量。 双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%。 对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化

4、或DNA变性。,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,(3)加DNA样品 载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,(4)凝胶电泳的标准DNA (5)电泳条件 (6)溴化乙锭染色和紫外观察 通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。,EB被认为是一种强致癌物质 EB可用来检测单链或双链核酸,当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB

5、情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp,SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳,在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度

6、。,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）,1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。,DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;,（四） 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel elec

7、trophoresis PFGE,为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。,PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。,脉冲电场电泳示意图,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotatin

8、g gel) 钳位均匀电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),（五）变性凝胶电泳,RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所抽提的总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。,总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,RNA电泳图,DNA变性凝胶电泳主要用于检测DNA分子中的碱基组成的变异。电泳过程中当双链DNA分子处于变性条件时，解离成单链，在有变性剂的凝胶中泳动速度发生变化，最终停下在特定的位置，碱基组成不同则停在不同的位置。,该方法是将PCR扩增的