不同地理位置的微生物差别PPT课件

1、1,取自中国不同地区活性污泥样本中细菌群落的 焦磷酸测序分析,蒋一凡&刘苗苗&熊蓓蓓,2,材料：活性污泥,来源:8城市，10市政WWTPs，曝气池 东部 西北 北部：SJZ（工废） 这些WWTPs主要处理生活污水，大多数WWTPs采用（A/O，A/A/O，OD） 样本处理：无菌塑料瓶（11） -80 一个晚上 干冰运输 实验室,WX（CAST）,MAS,SZ（工废，SBR）,HF（工废）,NJ,LZ（工废，CASS）,ULMQ（AB）,3,研究目标,估计来自不同地理位置样本的细菌群落组成的相似性和差异性 获得活性污泥样本中微生物相互作用的更好理解,4,研究意义,研究这些复杂又多样化群体物种（共

2、生模式）之间的相互作用能够很好地理解在污水处理过程中这些细菌群体的作用 作用：细菌在活性污泥中起主导因素而且在去除有机污染物，毒素和营养素起到重要作用 对活性污泥中细菌组成的更好理解可以提供有用的信息去改善污水处理效率以及阐明微生物对活性污泥的形成，发展和功能的影响,5,研究方法的确定,第二代高通量测序：提供足够的序列长度来覆盖复杂的微生物群体,网路分析：分类关系是活性污泥中细菌群落形成的主导因素,6,研究方法及过程,DNA提取 PCR扩增（聚合酶链式反应） 焦磷酸测序 序列分析 数据分析 网路分析,7,各研究方法的目的,高通量测序：活性污泥样本中细菌群落的组成 NMDS和ANOSIM：活性污

3、泥中细菌群落构成的显著的地理性差异 16s rRNA基因检测技术：细菌多样性 网路分析：10个污水厂中细菌的共生模式,8,DNA提取,50ml样本，4000rpm（4）离心15min 将悬浮液倒出，每个样本的三倍颗粒量（大约0.3g）用来DNA提取 0.8%琼脂糖凝胶电泳：原DNA分析 土壤微生物DNA强力提取试剂盒(人工指令):相同样本中抽取的三份DNA进行结合和提纯 生物光度计：分析提取DNA的质量,9,PCR扩增,细菌的16S rRNA基因扩增： 引物533R（5-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3） 引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3） 533R：R

4、oche 454“A”焦磷酸序列适配物，唯一的10 个碱基对序列 27F：Roche 454“B” 反应体系（50 l）：10 l 5 Prime STAR Buffer (Mg2+Plus），0.2 mM dNTP，0.4 M的每个正向和反向引物，2.0 U TaKaRa Prime STAR HS DNA 聚合酶 ，100200 ng DNA模板 循环条件：95C初始变性5min，94C 进行24个变性周期30s，55C退火30s，72C扩展30s，72C 扩展5min PCR产物：2%琼脂糖凝胶检查，DNA凝胶提取试剂盒提纯,10,焦磷酸测序,扩增子库：三个独立PCR产物的混合物 目的：

5、使潜在的场PCR误差最小化 不同污泥样本的扩增子混合 目的：实现同等质量浓度 合并后的样本被送到上海的Majorbio公司进行基于Roche 454 FLX钛平台的焦磷酸测序 获得的原始数据已经存入NCBI short-reads归档数据库(加入数字：SRX450095）,11,序列分析,获得的序列数据使用Mothur1.30然后454SOP进行处理 在进一步分析中排除：不包含精确匹配到引物的序列，含有任何模棱两可的读数和/或者拥有平均质量分数少于27且少于200个核苷酸(除了引物/碱基对序列区域)的序列 how? 两两母体的距离用Mothur计算，在3%的距离使用更进一步的临界方法，获得的数

6、据集中到OTUs 序列被随意二次抽样,所获得的序列的最小值 进行alpha和beta多样性分析,12,数据分析,二次抽样的序列被用来分析alpha的多样性，包括使用Mothur中的summary.single指令进行Chao1和Goods的覆盖率估计 NMDS分析使用R vegan（版本：2.15.0）来研究细菌群落组成的相似性。0.2的应力水平对于NMDS情景是可以被接受的。相似性分析被用来检测不同群落的细菌群落组成的差异性（如西北和东部群落），相似度分析用来识别OTUs，OTUs指定西北或者东部样本。 Mantel测试采用在R 2.15.0 环境下的vegan并通过999个排列数字实施：研

7、究细菌群落组成的差异性和样本所处地理距离之间存在的联系 Heat map通过R gplots执行：比较在每个样本中最充沛的属的细菌群落,13,网路分析,建立一个相关母体：通过计算细菌属间所有可能的成对秩的等级相关来设想网路界面的相关性 只考虑那些发生在所有样本中关系比例总共超过1%的至少3个样本的属 充分同时发生的事件：秩的相关系数不仅0.6（或者-0.6），而且统计上显著的（P0.05）稳定的相关性。统计分析使用R Hmisc。 在描述从充分属的成对比较中识别的稳定相关性的相关网路中，每个节点表示一种属，每一条线表示一种强烈和显著的相关性 在观察网路之后使用Gephi进行计算,14,图表分析

8、1,1、各样品的覆盖率为90以上，表明足够测序深度,15,图表分析2,每个活性污泥的细菌群落分配在分类单元为门的分类结果,16,图表分析3,每个样品中的前10丰富属被选定（所有的10个样品共37个属），与其他样品中它们的丰富度使用热图分析进行比较。有三个属至少在7个样品中都是大量的（1%），包括Haliscomenobacter、暖绳菌属、TM7_genus_IS，在37个丰富属中，发现了如Iamia、Ilumatobacter、分枝杆菌等好氧菌。同时，大量的厌氧菌诸如Ignavibacterium，Anaerolinea和Caldilinea也被发现。一些属，包括GP4、GP6和OD1_ge

9、nus_IS，没有得到很好的观察，并且不能明确地分为需氧或厌氧细菌。,17,分析图表4,细菌群落组合物与采样的地理位置密切相关 ANOSIM：确定在不同的地理位置收集的样品细菌群落组成是否存在显著的统计学差异。如东部和西北部（R =1，P 0.01） Mantel：细菌群落结构的差异性和采样点的地理距离之间的相关性 结果：地理距离与细菌群落结构的变化呈显著的正相关性（ R =0.6395，P =0.002）,18,分析图表5,SIMPER：东部和西北组之间的差异主要由前15个OTU促成 几乎大部分的这些OTU独占一个地理区域,19,分析图表6,网路分析：探索基于活性污泥样品中的细菌组件这一假设

10、是非随机,20,分析图表六,对于整个细菌网路，从61细菌属对165对显著和稳定的相关性进行鉴定。其中86对正相关，而79对负相关。每个网路模块化指数分别为0.694和0.591。模块指数 0.4说明网路具有模块化,显著和稳定的内部正相关和门的相互联系。酸杆菌门的成员（属Gp 3，Gp4，Gp6，Gp7,Gp16，Gp 17）,共现频率为2.94，比随机联系下预测的更高,正如从观察到的共生事件和理论随意性共生事件计算的一样。正相关由图4a中橙色厚边缘直观地显示。此外,对于门的相关性，-变形菌的成员往往与放线菌和壁厚菌门的成员共现。图4 b演示了一些细菌属之间的负相关。一个独立门的负相关在杆菌门的

11、Haliscomenobacter和Ferruginibacter之中被发现,21,结论,从中国西北和东部收集的活性污泥样本中的细菌群落组成显然不同 核心属与活性污泥的地理位置及处理方法无关 网路分析：从61细菌属鉴定，总共165对显著和稳定的相关性（正相关和负相关），2个网路化模块具有模块化结构,22,THANKS,无锡,兰州,马鞍山,苏州,石家庄,乌鲁木齐,合肥,南京,24,*process,测序从反向引物（533R）开始，原序列的反向互补序列被转换。剩下的序列用Mothur采用NAST（接近调整空间终端）算法与细菌SILVA 16S rRNA 基因模型进行比对，因为这个模型已经提供变化区域的质量比对。Mothur 中“pre.cluster”指令被用来消除那些有可能由于焦磷酸测序引起误差的序列。PCR嵌合体使用chimera.uchime指令实现用默认参数的Mothur软件进行检查和消除。剩下的序列被送到