第二章 菌种.ppt

1、第二章 菌种选育、保藏与复壮,本章内容,为什么选育菌种？ 菌种的重要性？ 菌种的选育方法自然选育 人工诱变 杂交育种 原生质体融合 基因工程构建 为什么要菌种保藏？ 为什么要复壮？,重点内容,菌种的选育方法; 菌种选育的理论基础; 人工诱变、杂交育种、原生质体融合的原理和操作方法; 营养缺陷型的筛选、检出、鉴定。,发酵的原动力：微生物。 优良的生产菌种：大幅提高产品的产量、质量和花色品种，提高生产效益。 发酵的成功：获得优良菌种及提供保证该 菌种能发挥最大潜在生产能 力的工艺过程。 优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的。,微生物工业对菌种的要求,能在廉价原料制备的培养基上迅速生长,生

2、成所需的代谢产物产量高。 培养条件易于控制 生长迅速，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体能力强 菌种不易变异退化 安全性（不是病源菌，不产毒素）,从菌种的遗传学特征上菌种分为：,野生型：产量低、难于直接用于生产,人工选育的优良菌种：发酵工业生产,发酵工业重点工作：选育优良菌种 并保持稳定生产特性,工业菌种育种的方法,自然、诱变、杂交育种、原生质体融合技术育种、基因工程育种等 举例： 将人工合成的人胰岛素基因与大肠杆菌的质粒结合，形成重组DNA，再把重组DNA导入大肠杆菌细胞内形成工程菌。 通过筛选可培养出能生产人胰岛素的菌种。,菌种保藏的意义,菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料

3、，菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 菌种保藏的任务： （1）使菌种不致死亡 （2）尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,第一节 菌种选育,菌种选育：,由于自然的或通过人工的方法使微生物发生变异，再通过识别、分离、筛选得到有优良性状的高产菌株的过程。,一、微生物菌种选育的理论基础,微生物菌种选育的理论基础及内容,理论基础： 微生物遗传学和分子遗传学 内容： 基因突变型菌株的识别与筛选。,突变：微生物进化的源泉 突变具有分子性质，包括： （1）对遗传作用的基因突变、基因调控及指令下的环境调节 （2）胞内外调节的解除 （3）基因重组及转移等建造新的突变菌

4、株。,（一）微生物的遗传和变异性,遗传和变异是生物界最基本的属性。 遗传：亲代传递给子代一套实现与其相同性状的遗传信息。 只有当子代个体生活在合适环境下，才能表达出与亲代间相似、连续的性状。 变异：子代个体因生活环境和其他因素发生改变而与亲代间的不连续、差异性的现象。,遗传和变异的关系,遗传是相对的，变异是绝对的。 有变异，生物才能进化。 遗传和变异是相互关联，同时又相互矛盾对立，在一定条件下，二者是相互转化的。,微生物遗传与变异与高等生物相比的特点：,（1）微生物繁殖快，生活周期短，环境因素重复影响微生物，个体易变异，并迅速繁殖形成群体，便于自然和人工选择。 （2）个体小、比表面大，环境可以

5、直接影响细胞，易于变异。 （3）大多以无性繁殖为主，便于建立纯系，一旦变异，很快在性状上表现出来。,微生物变异包含：,稳定性变异： 环境因素改变基本代谢过程改变保持形态和生理特性，不能回复到变异发生前状态。 不稳定变异： 变异是暂时的环境正常时形态和特性回复 原状。 长期不稳定变异稳定性变异,（二）遗传变异的物质基础,1、研究历史 1866年，奥地利孟德尔，豌豆杂交试验 -遗传学基本规律。 1910年，果蝇为材料 -确认基因存在于细胞核和染色体中，但不认识基因的物质内容。 3个经典实验（肺炎双球菌的转化实验、烟草花叶病毒实验、噬菌体感染实验） -核酸是遗传的物质基础。,肺炎双球菌的转化现象：

6、S型：菌株有毒，在人体内它导致肺炎，可使小鼠患病死亡，其菌落是光滑的； R型：菌株无毒，在人或动物体内不会导致病害，菌落是粗糙的。 只有S型细菌的DNA才能将肺炎双球菌的R型转化为S型。说明S型菌株转移给R型菌株的是遗传因子，即DNA才是转化因子。 决定微生物遗传的物质也只有DNA。,噬菌体的感染实验,1952 年利用示踪元素，对大肠杆菌 T2 噬菌体进行了实验。DNA含P不含S，蛋白质含s不含P。 先用含有两种元素的培养基培养大肠杆菌， T2 噬菌体进行吸附和侵入 搅拌洗涤、离心沉淀，分别测定沉淀物和上清液中的同位素标记。 结果发现，几乎全部 35S 都在上清液中，而几乎全部 32P 和细菌

7、一起出现在沉淀物中。,烟草花叶病毒的拆开与重组实验,1956 年将TMV拆成RNA(因该病毒不含DNA)和蛋白质，对烟草进行感染实验 结果发现只有 RNA能感染烟草，并在感染后的寄主中分离到完整的具蛋白质外壳的TMV 。 后来将甲、乙两种变种的TMV拆开，在体外分别将甲病毒的 RNA和乙病毒的蛋白质结合，将乙病毒的RNA 和甲病毒的蛋白质结合进行重组。 接着他把这些经过重组的病毒分别感染烟草。结果从寄主分离所得的病毒蛋白质均取决于相应病毒的 RNA。证明了核酸(RNA)是TMV的遗传物质基础。,2、DNA的结构与化学组成,（1）DNA的化学组成 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleica

8、cid), 高分子化合物，基本单位是脱氧核苷酸, 相对分子质量2.3104-11010， 比蛋白质相对分子质量(51035106)大。,核酸：以核苷酸为基本单位。核苷酸：核糖（五碳糖）、磷酸、碱基通过 共价键连接,每条多核苷酸链上均有四种碱基： A(腺嘌呤adenine)、 T(胸腺嘧啶thymine)、 C(胞嘧啶cytosine)、 G(鸟嘌呤guanine)有序地排列。,（2）DNA的结构,DNA是遗传物质的基础。 DNA为什么能起遗传作用？ DNA怎么起作用的呢？ 这些与DNA的分子结构密切相关。,1953年由X射线衍射结构分析提出DNA分子双螺旋结构理论和模型： DNA是由两条反向平

9、行的多核苷酸链围绕同一中心轴构成的右手螺旋结构。（P14),碱基配对,每条多核苷酸链上四种碱基有序排列 它们以氢键与另一条多核苷酸链的四种碱基相连： A (腺嘌呤)与T (胸腺嘧啶)配对, C (胞嘧啶)与G (鸟嘌呤)配对,遗传的稳定性,遗传稳定性的保证：特定的种或菌株的DNA分子，其碱基顺序固定不变 如果DNA的个别部位发生了碱基排列顺序的变化，则会导致菌株死亡或发生遗传性状的改变。,（3）DNA的复制,菌株细胞在分裂之前，DNA须精确复制，才能保证微生物的所有属性都得到遗传。 而DNA的独特的半保留式的自我复制能力，确保了DNA复制的精确性，并保证了一切生物遗传性的相对稳定。,DNA的自

10、我复制,DNA分子中的两条多核苷酸链之间的氢键断裂双螺旋解旋和分开每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。 新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基排列顺序完全一样。 在此过程中，每个子代分子的一条多核苷酸链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，又以氢键连接成新的双螺旋结构。,RNA,RNA(ribonucleicacid)又称核糖核酸 四种类型：tRNA、rRNA、mRNA和反义RNA 它们均由DNA转录而成，和DNA很相似，不同的是：以核糖代替脱氧核糖， 以尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T)。 碱基配对为：AU、UA、GC、CG,3、遗传物质在细胞中的存在方式,（1）真核生物 DNA

11、在染色体上。 真核生物的细胞核有核膜包裹，形成有固定形态的真核，核内的DNA与组蛋白结合在一起，形成在光学显微镜下可见的染色体即基因组。,（2）原核生物,原核生物的细胞核没有核膜包裹，呈松散无定形的核质体状态存在。 这种核基因的DNA不与任何蛋白质相结合，每个细胞只有一个环状染色体，无核膜包裹，DNA分子呈裸露状态。,（3）质粒,有些细菌细胞存在非核染色体的共价闭环状DNA分子，具有自主复制功能，并带有特殊遗传性状的基因，此非染色体的环状DNA为质粒。,质粒的特点：,1、质粒的存在并非微生物生命活动必需。 2、不同类型的质粒其质粒数各异，同一质粒在不同条件下，质粒数差异很大。 3、质粒DNA分

12、子常呈现三种形态； 一种是共价、闭环状DNA(CCC DNA)； 其次是由于条链有缺口而产生的开环DNA(ocDNA)； 第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性DNA。,（4）基因与染色体,基因是一切生物体内储存遗传信息的、有自我复制能力的遗传功能单位。 遗传物质的最小功能单位。 它是DNA分子上一个具有特定碱基顺序，即核苷酸顺序的片断。 一个基因约有1000个碱基对，每个细菌约有5000至10000个基因。,基因控制遗传性状，但不等于遗传性状。 任何一个遗传性状的表现都是在基因控制下的个体发育的结果。 从基因型到表现型须通过酶催化的代谢活动来实现。 基因直接控制酶的合成（即控制生化步骤，控

13、制新陈代谢），从而决定遗传性状的表现。,通过人为改变DNA的结构，以改变微生物的遗传特性，达到改造和选育菌种的目的。,二、自然选育,自然选育（维持正常生产的稳定）,微生物菌种选育的手段之一； 菌种选育的经典方法。 利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性状的菌株，选择出维持原有生产水平或有更优良性能的高产菌株。,由于自发突变的正变率很低，多数菌种产生负变异，导致生产水平下降。 （自发突变中正变几率低高产菌株几率低） 自然选育的目的： 维持生产稳定（生产中要经常进行自然选育工作）。 首先了解菌种退化的原因：,（一）菌种的退化变异,菌种退化： 菌种经过长期人工培养或保藏，由于

14、自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。,1、菌种退化的表现：,生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型，具体表现： 菌落及细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越小； 代谢产物生产能力下降； 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,2、菌种退化原因,（1）遗传基因型的分离：群体繁殖 （2）自身变异的产生 负向变异生长速度变慢；孢子形成能力低下。 （3）人工诱变导致的退化变异 诱变后菌株不纯，多核细胞中单核突变等； （4）其他原因 菌种保藏不当、生长条件不满足 、回复突变 退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，在群体

15、中最后数量占优势。,3.防止菌种退化的措施,控制传代次数 选择合适的培养条件 选择合适的保藏方法 菌种稳定性检查 分离复壮,混杂的群体中分离出高产性状的微生物，从而获得纯种微生物的方法： 自然选育（简便易行）,（二）自然选育,原理：把微生物群体分离。 方法：制成菌悬液选择合适稀释度分离。 步骤：通过表现形态淘汰不良菌株 通过目的代谢物产量的考察 进行遗传基因型纯度试验 传代的稳定性试验,带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置,1、自然选育 采样 增殖培养 从自然界选育菌株 纯种分离 性能鉴定 从自发突变中选育菌株,从自然界分离获得菌株,（1）、分离思路 新菌种分离：从混杂的微生物中依照生产要求

16、、菌种特性，采用各种筛选方法，快速、准确挑选需要的菌种。 实验室或生产用菌种：若不慎污染了杂菌，必须重新分离纯化。 有了优良菌种，还要有合适的工艺条件、合理先进的设备与之配合。,（2）自然界分离微生物的一般操作步骤,定方案：查资料，了解菌种的生长培养特性 采样：有针对性地采集样品。 增殖培养：人为地通过控制养分或条件，使菌种 增殖培养后，在数量上占优势。 纯种分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、生长和发酵最适温度、最适pH值等。,a 采样和采集方法,为了从特定生态系统中分离出有代表性的菌群，须重视样本采集。 样本采集时所需的工具：无

17、菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。,b 增殖培养,给混合菌群提供有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，使目标菌株大量繁殖，有利于分离。 碳源、氮源、温度、PH值等 如碳源：可选定糖，淀粉、纤维素，或者石 油等，以其中的一种为唯一碳源。 这样对下阶段的纯种分离会顺利得多。,C 纯种分离,尽管增殖培养效果显著，但仍处于微生物混杂生长状态。因此须分离，纯化。 增殖培养的选择性控制条件应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。 纯种分离的方法： 划线分离法 稀释分离法。,1.稀释平皿分离法,1.稀释平皿分离法,100ml,1g,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml

18、,9ml,1/100,1/1000,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,(1)稀 释,1.稀释平皿分离法,2.平皿划线分离法 a.分区划线分离法 b.连续划线分离法,d 筛 选,采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合工业生产用菌种。,e 毒性试验,自然界的一些微生物在一定条件下产毒素，将其作为生产菌种应当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。 国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,(3).自然选育的

19、优缺点优点：所有菌种选育的前提条件; 简单易行的方法,可以达到纯化菌种,防止菌种衰退、稳定生产、提高产量。缺点:自然选育的效率较低,分离出的天然菌种生产性能比较低下。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）,文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂）80度30分钟处理 0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落 从285个土样中获得62株： 26株为组成型， 36株为诱导型,从自发突变体中获得菌株,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9 自然突变有两种情况：正突变 负突变,三、诱变育种,诱

20、变育种,（1）定义：人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中，使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选有优良性状突变株的过程。 1940S：开始诱变育种（青霉素高产变异菌株） 目前：比较经济、高效的育种方法。 因为：一是对生物调控机制了解不够透彻； 二是基因工程方法耗费大。,（2）理论基础:基因突变 （3）优点: 提高突变频率和扩大变异谱，菌种选育速度快、收效显著、方法简便。缺点: 诱变育种缺乏定向性，工作量大； 有的诱变因素对某些菌种的作用不明显，同时对高产菌株进一步提高产量较困难。,（一）突变,突变：指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化。 突变分为：基因突变和染色体畸变 基因突变（点突变）：

21、只涉及少数核苷酸碱基的改变。 染色体畸变：大段核苷酸或染色体的突变。,自发突变：自然状况下发生。 频率低，对育种不利。 诱发突变：人为地用物理或化学因素（诱变剂）诱发。 突变率大大提高。,（二）诱变,物理、化学或生物诱变方法,1、诱变剂和诱变处理,诱变剂：用来处理微生物并能提高生物体突变频率的物理或化学因素。 （1）种类(P17) 物理-紫外线等各种射线,激光 ,超声波,快中子等;化学-甲基磺酸乙酯,亚硝基胍等;生物诱变剂-噬菌体,转座子等。,物理诱变剂,紫外线（方便有效）、X射线、射线 许多高产菌株选育都用过紫外线，对实验室、中小型工厂适用且安全。 紫外线对生物诱变最有效的波长是200300

22、nm，其中260nm左右作用最大。,嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。紫外线的作用：使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，它会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡。 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。,其他几种射线都是电离性质的，有一定穿透力，一般由专业人员在专门设备中使用，否则有一定危险性。,超净工作台,小型X射线衍射仪,Co60射线机,化学诱变剂： 化学因子如烷化剂、碱基类似物、5氟尿嘧啶等。 使用最多、最

23、有效的是烷化剂。,使用化学诱变剂的优缺点： 1、多数情况下，突变数量比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂：经济，只需少量合适的诱变剂，设备是一般玻璃器皿、一个蒸气罩。 电离辐射：设备费用大，且须注意安全。 3、大部分诱变剂是致癌剂，在使用中须谨慎，避免与皮肤接触，勿吸入其蒸气。 有人对某些诱变剂敏感，未直接接触就过敏，更要当心。,生物诱变剂,主要是指噬菌体，可用作抗噬菌体菌种的选育。 作用原理：可能与传递遗传信息、诱发抗性突变有关。,（2）诱变剂的选择,可选一种（物理或化学）也可二者复合使用 紫外线：主要作用在DNA分子中的嘧啶上； 亚硝酸：主要作用于DNA分子的嘌呤上； 1碱基类似物高特异性，

24、但回复突变率高，使用少。 2亚硝酸类和烷化剂应用范围广，造成的遗传损伤较多。 “超诱变剂” 甲基磺酸乙酯：毒性最小诱变剂之一。 3吖啶类诱变剂：可造成生化代谢途径的完全中断。 4紫外线：仍十分有效。,（3）诱变剂量的选择,一般以致死率选择采用的剂量。 如：UV处理，致死率为90%99.9%； 现在，有的采用低剂量7080%，甚至3070%。 如果菌株不稳定，要求稳定地提高其发酵单位：宜用缓和的因子和低剂量。 如果出发菌株比稳定，要求突变幅度大： 用较强的诱变剂和诱变剂量。,2、诱变育种步骤,出发菌株的选择 处理菌悬液的制备 诱变处理 中间培养 分离和筛选,（一）诱变育种的一般步骤和方法出发菌株

25、同步培养 使菌细胞处于相同或接近的生理状态单细胞（或单孢子）菌悬液的制备 单细胞或单孢子的意义 酵母或霉菌孢子106 /ml 、细菌108 /ml 诱变剂的选择及其剂量的确定 以致死率为9099 为宜诱变处理 物理诱变剂 化学诱变剂,确定出发菌株 菌种的纯化选优 出发菌株的性能鉴定 同步培养 制备单细胞（或单孢子）悬液 活菌浓度测定 诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异的菌落数，计算突变率 挑取疑似突变菌落纯培养 突变体的初步筛选 用简单快捷的方法 重复筛选 摇瓶发酵试验 选出突变体（根据情况进行生产试验或重复诱变处理）,微生物的诱变育种,（1） 出发菌株的选择（

26、6个）,(1) 自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，易达到好效果。 (2) 在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相像，也是良好的出发菌株。 (3) 每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。 (4) 出发菌株开始时可同时选23株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。,(5) 尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体 作 出发诱变细胞（原因：变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因）。 (6) 根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂（原因：同一诱变剂重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降）。 诱变剂若作用于营养细胞，要选对数期细胞： 若作用于休止期，可选用孢子

27、。,（2） 处理菌悬液的制备,此步骤的关键： 制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并离心，洗涤，过滤。,带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水,（3） 诱变处理,根据前面有关诱变剂及诱变处理的原则，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。,紫外线的诱变育种,一般采用15W紫外线杀菌灯。灯与处理物的距离为1530cm，照射时间依菌种而异，一般几秒至几十分钟。 一般常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在7080%为宜。 光复活作用（P19）照射时和照射后的处理应在红灯下进行。,紫外线的诱变育种操作步骤 1细菌培养液离心，倾去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再离心

28、洗涤。 2菌悬液放入灭菌且有玻璃珠的三角瓶内摇动，打散菌体。将菌液过滤，单细胞滤液装入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞数可达108个ml，作为待处理菌悬液。 3取24m1制备的菌液加到培养皿内，置磁力搅拌器上、15W紫外线下30cm处。（正式照射前，先开紫外线灯10min预热，然后开启皿盖搅拌下照射1050s。)到时间后，在红灯下进行增殖培养，或用黑纸包住（避免光复活作用） 4取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml稀释分离，计数活菌细胞数。 5取照射菌液2ml于液体培养基中，振荡培养46h。 6取中间培养液稀释分离、培养。 7挑取菌落进行筛选。,亚硝基胍诱变曲霉菌操作步骤 N-亚硝基胍对

29、真核或原核微生物都有强烈诱变作用。 1单孢子悬液制备 取斜面，加入磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管，过滤，制得单孢子悬液。若孢子液浑浊，孢子浓度可达106个ml，为待处理孢子悬液。 2MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg，加入pH 6.0磷酸缓冲液，于暗处振荡溶解。 3诱变处理 吸取MNNG溶液1ml，加入到1m1孢子悬液中，30振荡30min，立即稀释1000倍停止作用，然后以10-2，10-4两个稀释度分离培养，30 3天后计数。 4死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30下培养3天。根据处理前后活孢子数可计算死亡率。 5挑取菌落进行糖化酶

30、及蛋白酶产量筛选。,（4） 中间培养,由于在发生了突变尚未表现出来之前，有表现延迟过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。 此过程对今后的筛选、获得稳定菌株极为重要。,中间培养方法： 让变异处理后的细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯变异细胞。这样，隐性变异会显现出来。 若不经中间培养，直接在平皿上分离，会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。,（5） 分离和筛选,诱变育种的2个重要环节： 诱变，筛选 微生物诱变处理后，变异频率和变异幅度均提高，但优

31、良突变株的产生频率非常低。 要从大量变异株中将极少优良变异株筛选出来，需要正确筛选方法。,筛选分 初筛和复筛。 初筛：目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。 初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。 复筛：目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,初筛可在平皿上以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。 在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。 在以后的复筛阶段，还应不断结合自

32、然分离，纯化菌株。,摇床复筛,降解纤维素产生透明圈,病毒产生产空斑,微生物的诱变育种,变异菌株的初步筛选,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,四、微生物杂交育种,微生物变异的途径： 基因突变（自然选育、诱变育种） 基因重组（杂交育种、原生质体融合、基因工程） 诱变育种（菌种选育主要方法）：但长期诱变处理生活能力下降（生产周期延长、产孢子能力下降、代谢速度慢）；诱变因子对控制基因的有效性降低。 所以：基因重组改变菌种遗传特性，优良菌株。,将两个不同性状的个体细胞内的遗传基因转移在一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的过程，称基因重组（遗传重组）,基因重组时，不发生任何碱基对结构上

33、的变化。 重组后生物体新的遗传性状的出现完全是基因重组的结果。,基因重组是分子水平上的概念（遗传物质分子水平上的杂交）， 而杂交是细胞水平的概念。 杂交必包含重组，而重组则不仅限于杂交一种形式。 它可以在人为设计的条件下发生，使之服务于人类育种的目的。,杂交育种：指将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合，随后细胞核减数分裂，遗传性状会出现分离和重新组合的现象，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。,但由于杂交育种方法复杂，工作进度慢，因此很难象诱变育种得到普遍推广和应用。,一、杂交育种的目的,1、使不同菌株的遗传物质交换和重新组合，从而改变原有菌株的

34、遗传物质基础，获得杂交菌株（重组体） 2、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至改变菌种特性，获得新品种。 3、获得的重组体可能对诱变剂的敏感性得以提高和恢复，以重新使用诱变方法选育。,二、杂交育种的程序,1、菌种准备 菌株：原始亲本和直接亲本菌株。 原始亲本菌株：用于杂交的野生菌株（不同系谱；或相同系谱但代数相差多），遗传基础差别大重组后变异大；菌种特性清楚，遗传标记明显，有生产上需要的特性（高产、代谢速度快等）。,直接亲本菌株：直接用于配对的菌株，原 始亲本经诱变处理得到。 直接亲本菌株：做遗传标记。 常用的标记：营养、形态、抗性、敏感性、 产量、酶活力。 用的最多的是

35、：营养缺陷型（诱变后）,（1）营养缺陷型的选育,营养缺陷型：指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 与营养缺陷型对应的是野生型。,（2）营养缺陷型的用途,在生产上和科学研究上用途很大。 目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。 要研究代谢途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。,（3）筛选营养缺陷型的步骤,诱变 淘汰野生型 检出缺陷型 确定生长谱,（a)、诱变,物理诱变 化学诱变,(b)、淘汰野生型,中间培养后的细胞中除营养缺陷型菌株外，仍有大量野生型菌株，为便于筛选，须将野生型细胞大量

36、淘汰，以浓缩营养缺陷型细胞。 常用抗生素法和过滤法。,（1）抗生素法： 野生型能在MM中生长，而缺陷型不能。 将诱变处理液在MM中培养短时,野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。 细菌或酵母对抗生素敏感，相应加入一定量的抗生素，活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。 细菌可采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。,（2）菌丝过滤法： 霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸(滤膜)过滤法将菌丝滤去。而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。,(c)、检出缺陷型,原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同： 缺陷型在完全培养基上生长良好，而在基本培养基上不生长， 野生型都能

37、生长。 具体方法：影印法、点种法、夹层法,检出营养缺陷型,影印法是在细菌抗药性变异研究中发展起来的技术。 目前已在放线菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育种中广泛应用。,(1)影印法,1将一较平皿直径小1cm的金属圆筒蒙上灭菌丝绒，灭菌。 2将完全培养基上长出的菌落在丝绒上轻压，成为印模，标记方位。 3将MM平皿和CM平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压，此菌印模即复印于上。 4 将CM和MM在恒温箱中培养。 5二平皿相同方位进行比较，可发现在MM平皿上长出的菌落少于CM平板上的。 MM上未长而相应于CM上长出的那几个菌落:就可能是缺陷型。,此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之间应有一定间隔。,(2)

38、点种法,即：任意法。 把浓缩的菌液 ( 细胞或孢子 ) 在完全培养基上进行分离培养，用接种针或牙签将CM上长出的菌落在MM和CM两副平板上接种，依次在相应位置点种，然后培养，观察其生长情况。 此法结果明确，但工作量大。,(3)夹层法,先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基，凝固后涂上一层含菌的MM，凝固后再倒一薄层MM琼脂培养基，培养24h，将出现的菌落标记，然后倒上一层CM琼脂培养基，再培养。这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。 缺点：结果有时不明确;且将缺陷型菌落从 夹层中挑出并不很容易。,这种方法一般适用于细菌。,(4)限量补充培养基检出法,将经过浓缩的菌液接种在含有微量 (0.6 或更少 )

39、 蛋白胨的 MM 培养基上培养： 野生型迅速生长成较大的菌落； 营养缺陷型生长较慢，故长成小菌落而得以检出。,(d)、营养缺陷型生长谱的确定,验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。 即：在基本培养基中加入某种物质时，能生长的菌便是某种物质的缺陷型。,生长谱法,步骤: 首先鉴定需要那一类生长因子，可用天然产物的混合物检测， 其次鉴定具体因子。,缺陷营养类别的确定 常用于确定营养缺陷型类别的天然混合物有：不含维生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白胨；水溶性维生素混合物； 0.1%碱水解酵母核酸液等。 检测方法可用滤纸法。取 0.5cm 直径的滤纸片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上

40、培养，只要在此滤片周围能长出菌，即可说明此营养缺陷型的类别。 缺陷营养因子的确定 缺陷型营养因子可能是一种，有时会是二、三种或更多。检测可用上述滤纸法，亦可用营养组分分组法,2、杂交育种使用的培养基 基本培养基(MM):满足野生型菌株正常生长 的培养基 补充培养基(SM):在基本培养基中加入相应 的营养成分,以满足相应 的营养缺陷型菌株生长需 要（其他营养缺陷型仍不 能生长） 完全培养基(CM):能满足各种营养缺陷型生 长，如牛肉膏蛋白胨培养 基、麦芽汁培养基等。,三、杂交育种的方法1、 酵母菌的杂交育种,酵母菌通过有性杂交进行杂交育种。 包括：子囊孢子的形成、 子囊孢子的分离、 酵母杂交种的

41、获得三个步骤。 酵母菌的育种：在食品工业中占重要地位。其杂交育种工作开展较早，成果显著。,如： 在面包酵母种间进行杂交，获得生产性能良好的菌株，其繁殖能力和发酵能力比亲本菌株强； 采用面包酵母和酒精酵母杂交，其杂交种的酒精发酵能力没有下降 而 发酵麦芽糖的能力却比亲本菌株高。,在啤酒酿造中，用上面酵母和下面酵母杂交，得出的杂种可生产出浓度和香味更好的啤酒等。 以上这些酵母均具有不同的交配型，因而都是通过有性杂交获得。,2、 霉菌的杂交育种,霉菌的杂交育种：主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。,如： 对黑曲霉杂交育种，得到多倍体的新种，其柠檬酸产量比原始

42、菌株高几十倍； 酱油曲霉通过体细胞的重组及多倍体化，提高了蛋白酶活性等。 目前霉菌的杂交育种主要是在种内，偶尔有种间的。但亲本菌株的亲缘关系越远，则越不易成功。,五、 原生质体育种,原生质体融合：指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合在一起，进而发生遗传重组，产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程。,原生质体育种技术主要有：原生质体融合、原生质体转化技术，原生质体诱变育种等。 原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法。 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。,细胞融合仪,一、原生质体融合育种的特点（7个）,(一)

43、杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 (二)受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 (三)遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程。,(四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 （五)有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 (六)提高菌株产量的潜力较大。 (七)有助于建立工业微生物转化体系。,二、原生质体融合育种步骤(P32）,1标记菌株的筛选和稳定性验证。 2原生质体制备。 3等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4涂布于再生培养基，再生出菌落。

44、 5选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 6生产性能筛选。,原生质体融合基本过程示意图,细胞壁,细胞壁溶解,细胞膜,营养细胞,原生质体,原生质体融合,融合细胞,原生质体融合,原生质体形成,细胞壁再生,三、原生质体融合育种的要点,（一）标记菌种的选择 采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或 抗药性菌株。 最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。,(二)原生质体的制备 制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性

45、。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。,四、影响原生质体制备的因素（6个）,1菌体的前处理 前处理是为使酶作用的效果好一些。 如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 2菌体的培养时间 为使细胞易于原生质体化，选择增殖期菌体。 3 酶浓度 对不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，且酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度随不同的生长期的菌体而变化。,4酶处理温度 5破壁时的pH值 6渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，且有助于酶和底物的结合。 渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。,用原

46、生质体技术提高发酵单位的例子,六、 基因育种,基因重组育种,运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经遗传物质的交换而转移给另个细胞的方法。,第二节 菌种保藏与复壮,一、菌种的保藏,微生物发酵工业中，获得良好性状菌种不易。 如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种长期保藏后不但存活健在，且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物的高产能力，即很少发生突变，对菌种极为重要。,（一）、菌种保藏的意义,菌种是从事微

47、生物学以及生命科学研究的基本材料，如利用微生物进行有关抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。 所以菌种保藏是进行微生物学研究；微生物育种工作的重要组成部分。 菌种保藏任务：使菌种不致死亡；设法把菌种优良特性保持下来而不致向坏方面转化,（二）、保藏注意事项：,防止杂菌污染，做好无菌检查； 菌种要在新鲜的斜面上生长丰满，生长时间不宜过长； 防止退化及时复壮； 菌种制备过程注意：孢子量、斜面、浓度 培养基（斜面）：C/N少些，营养贫乏 使用保藏菌种时，用保存前使用的同一培养基上进行复壮。,（三）、 菌种保藏原理,挑选优良纯种，最好是休眠体， 创造最有利于休眠的环境条件，创造使微生物代谢不活泼，生

48、长受抑制的环境条件。 如：干燥，低温，缺氧，缺乏营养，添加保护剂及酸度中和剂等 干燥：硅胶，无水氧化钙，P2O5 低温：生长温度低限约为-30，水溶液中酶促反应温度低限-140,菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。,（四）、理想的菌种保藏方法应具备的条件,(1)经长期保藏后菌种存活健在； (2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,（五）、 菌种保藏方法,蒸馏水悬浮法； 斜面传代保藏； 干燥-载体保藏； 冷冻干燥保藏； 超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。,（ 1）低温保藏法 原理：低温对微生物的生命活动有抑制作用 根据所用的温度高低可分