上海交大网络课程检验微生物讲义12(1)

1、第二十章真菌一、教学大纲要求1、真菌的定义、主要生物学特性和主要病原真菌的致病性2、了解浅感染性真菌的种类和基本特性。3、掌握深部感染真菌和条件病原真菌的生物学特性和检测技术二、教科书的内容(a)真菌概述真菌是不含叶绿素，没有根、茎、叶分化的真核细胞型微生物。拥有细胞核和更完美的细胞器。细胞壁含有甲壳素和葡聚糖。真菌的种类很多，大约有10多万种。对人类造成疾病的只有300多种。近年来，真菌感染与传染病、肿瘤、慢性消耗性疾病等引起的免疫力下降、滥用抗生素引起的植物不平衡有关，增加了。单细胞真菌，也称为酵母，呈圆形或卵圆形，以出芽方式繁殖。有酵母和酵母，在固体培养基上生长的殖民地类似于细菌菌落。林

2、爽常见的隐球菌和假丝酵母。多细胞真菌由称为丝状真菌或真菌的菌丝体和孢子交织而成。孢子在适当的条件下出芽，伸长到芽管，和嘴一起延伸到称为丝状的细丝。菌丝体会徐璐纠缠，形成菌丝体。被称为气体菌丝体的菌丝体向上生长。有些延伸到被称为营养菌丝体的培养基上。能产生孢子的叫做生殖菌丝体。还有将具有允许细胞质循环的细胞膜的菌丝体分为多个细胞的菌丝体。细胞质循环称为菌丝体。大多数病原真菌的菌丝体是分离菌丝体。有些菌丝体没有隔膜，被称为郑智薰分离菌丝体。菌丝体有很多核。菌丝体有多种形态，可以根据不同的形态查明菌。孢子是真菌的生殖结构，可以分为成孢子和无性孢子。大部分病原真菌有分生孢子、叶孢子和孢子孢子孢子三种类

3、型，形成无性孢子。有些真菌在徐璐不同的环境条件下有两种形态：组织细胞质、孢子细菌、孢子菌等包含动物蛋白的培养基中培养到37 时，是酵母型的，在25 的普通培养基中可以表现出丝状细菌。霉菌干燥，对紫外线有很强的抵抗力，紫外线暴露30分钟左右才会死亡。如果发热量弱，在60 到1小时内死亡。对常用消毒剂的抵抗力强，对煤酸2%、汞0.1%、碘2.5%更敏感。常用的抗菌抗生素是不敏感的，amphotericin b、amphotericin、keconazol、伊曲康唑、grixamycin等有抗真菌作用。近年来，根据卡氏肺孢子虫的超微结构，其囊壁结构类似真菌细胞，大多数学者认为应该将其分类为真菌，并命

4、名为肺孢子菌。根据病原真菌的感染部位，通常分为深部或全身感染真菌、条件致病(饲料)真菌和浅感染性真菌。(b)常用真菌实验技术1.真菌实验注意事项(1)霉菌检测工作应在生物安全柜内进行。特别是粗孢菌、组织细胞质、皮炎芽生菌、新型隐球菌等的分离培养和鉴定工作，应在生物安全柜中进行。(2)每天工作前后工作区域要消毒。(3)从盘子上的培养基中散发出的气味渡边杏。(4)细胞质、孢子和孢子能在空气中传播孢子，因此要渡边杏培养。(。标本染色检查有些真菌，例如深部真菌，染色后要观察得更清楚，常用的染色方法如下：(1)革兰染色法适用于所有真菌呈革兰阳性，念珠菌、孢子丝菌及新感染的组织细胞质菌。(2)梅拉-李红或

5、陈诚-李红染色法适用于组织胞浆菌。(3)乳酸酚棉兰染色法适用于所有霉菌，方法是把霉菌染成蓝色。(。(4)糖原染色以碘酸为氧化剂，真菌细胞壁多糖物质氧化，释放醛基，与舒iff试剂中的亚硫酸钠及亚硫酸钠相互作用，呈红色。可以用来直接涂复标本的染色，组织切片的染色，或者重新染色已经染过苏木紫红色的组织切片。真菌是红色，背景浅绿色，核蓝色。糖原、透明质酸、粘液、透明蛋白、纤维蛋白、胶质粒子等都是红色的。(5)霍恩染色法(GMS法)的基本原理跟PAS染色法相同，该法用铬酸(铬酸)代替高碘酸。(。真菌染成黑色或黑棕色，菌丝体内部呈灰色紫色，糖原，粘液为淡红色。(6)粘液-卡洪(MCS)法用于鉴定新的隐球菌

6、，隐球菌细胞壁和荚果染成红色，细胞核为黑色，背景为黄色。(。孢子细菌和鼻孢子细菌的细胞壁也被染成红色。荧光染色用0.1%吖啶橙染色标本涂层和组织切片，通过荧光显微镜观察，白色念珠菌、皮炎芽生菌、球菌为黄绿色、新隐球菌、鼻孢子菌为红色、组织细胞炎红黄色、曲霉为绿色真菌的分离培养(1)培养基真菌的营养要求不高，最佳pH4.06.0。可以在普通细菌培养基中生长。真菌群在多种培养基上变化很大，一般以四宝药培养基为基准描述种群的形态。常用培养基有选择性、选择性和识别培养基。可选培养基为沙宝弱培养基、脑心提取物培养基和血液琼脂培养基。选择性培养基为0.05mg/ml和庆大霉素50100mg/ml，或者青霉

7、素20U/ml和链霉素40U/ml，或者氯霉素100mg/ml和庆大霉素100mg/ml，具体取决于细菌污染添加0.5mg/ml放线菌酮抑制腐败真菌的生长，但对隐球菌、近缘念珠菌、热带念珠菌、曲霉有抑制作用。确认培养基为土豆葡萄糖琼脂，酵母提取物琼脂，米粉排骨琼脂，蔡汉川等。(2)培养方法试管培养法、大培养法、小培养法。4.培养结果观察菌生长后主要观察种群的以下方面。生长速度，群体大小，表面形态，群体颜色，群体边缘，群体底部。殖民地特性：可分为酵母类型、酵母类型和思想集落。酵母菌落形状光滑，质地柔软，像奶酪，类似于细菌菌落。酵母样菌落与酵母样菌落相似，但制造了假菌丝体，并放入念珠菌等培养基中。

8、思想群体是多细胞真菌的群体形态，由棉絮、绒毛或粉末组成，随着菌种的不同，群体发生变化，是确认的重要依据。5.其他评估诊断技术(1)动物接种可以有效地分离病原真菌，确定真菌的病原真菌。通常，老鼠对新型接种隐球菌、孢子丝菌、皮炎芽生、组织细胞质细菌更敏感。巴西芽细菌，孢子细菌需要接种在豚鼠睾丸上。白色念珠菌，皮肤丝状细菌对兔子更敏感。(2)组织病理学检查组织检查是诊断真菌病的重要方法。染色后在组织内发现孢子或菌丝体，具有诊断意义。(3)真菌感染的免疫学检查主要取决于病因诊断。但是在急性组织细胞质疾病、曲霉支气管炎等一些情况下，需要依靠免疫学手段进行辅助诊断。真菌与其他微生物相比，抗体缓慢、滴落等过

9、敏反应严重。免疫血法用皮肤检查和乳胶凝集试验、酶联免疫吸附分析试验、补体联合试验、荧光抗体检查、放射免疫测定法测定血清中相应的抗体水平4.核酸检测：应用DNA探针杂交、PCR技术等分子生物学技术，从组织标本中检测真菌DNA，不断研究和实验。(b)浅感染性真菌浅感染性真菌包括皮肤表面感染性真菌、皮肤癣真菌及皮下组织感染性真菌。我国主要皮肤表面感染性真菌是马拉刺白菌，主要居住在人体皮肤和毛发干燥的最表面。这是一种能从健康人的皮肤中分离出来的病菌脂质酵母样细菌。皮肤癣菌是寄生在皮肤角质上引起皮肤浅感染的细菌，也称为皮肤思想细菌。只侵犯角化的皮肤，毛发，手指a部分。大约有45种，其中约有20多种对人致

10、病。分为白线菌、表皮白线菌、微球白线菌。我国红柳丝菌最多，其次是紫柳丝菌、柳丝菌、柔皮白线菌。在皮下组织中引起感染的真菌主要有着色真菌和孢子虫。创伤感染后皮下组织感染性真菌在局部真皮深处生长繁殖，慢慢扩散到周围组织，也可以通过淋巴扩散到全身。在我国，孢子虫最多，其次是梨籽着色菌。孢子丝菌广泛分布在土壤、灰尘和木材上，属于腐蚀性真菌。这种菌常因外伤引起孢子丝菌病。主要感染菌是神科孢子囊菌。(c)深部感染真菌1.隐球菌只有新生隐球菌及其变种具有致病性，新生隐球菌广泛分布在自然界，也可能存在于人类表面、顾颉刚和窗口。鸽子粪含有很多，通过吸入被鸽子粪污染的空气而感染，特别是对某些免疫缺陷者来说。新生隐

11、球菌在组织中呈圆形或卵圆孔状，直径一般为46m，在菌体外部有后盐膜，胶囊比菌体大13倍，折射性强，一般染色不易上色。常用墨汁负染色法，透明菌在黑底有较大的反射粒子和多个较小的反射粒子。一般的芽现象，细菌外有透明的胡福德。培养后菌体可变变小。无郑智薰致病隐球菌胶囊。新生隐球菌在25 和37 都生长，从白色到奶油色，形成粘稠的酵母群体，变成橙色，变成黄褐色。一些殖民地可能液化。可以分解尿素。新生隐球菌的胶囊多糖分为a、b、c、d等4种血清类型，我国临床标本主要为a型。此外，我国还发现了新型隐球菌上海变种。这种菌是外源性感染。用呼吸系统侵犯人体，可以在绝经血液流动时侵犯所有器官组织，主要是侵犯肺、脑

12、、脑膜，或者侵犯皮肤、骨头、关节。新生隐球菌在细胞免疫功能衰竭(例如AIDS、恶性肿瘤、糖尿病、器官移植和大量使用糖皮质激素)中很容易发生。因此，林爽上隐球菌脑膜炎经常发生在系统性红斑狼疮、白血病、淋巴瘤等。在国外，艾滋病最常见的并发症是艾滋病死亡的主要原因。以患者脑脊液作为墨汁的负染色检查是诊断隐球菌脑膜炎最简单快捷的方法，有大的反射粒子和多个小的反射粒子和出警，可以看出细菌外部有透明的后协。常规细胞染色用PAS染色后，可以发现隐球菌，例如新生隐球菌显示红色。氢氧化钾涂层发芽的细菌不能看到豆荚，必须识别淋巴细胞、脓细胞等。用乳胶凝集试验、ELISA和单克隆抗体法等免疫学方法检测隐球菌特异性抗

13、原已成为传统的林爽诊断方法，其中乳胶凝集试验最常用。在四宝药培养基上接种标本，致病性隐球菌可在37 下不生长，在25 和37 下孵化。培养25d后观察群体的形态特征，将群体作为墨子的负染色赠品。新生隐球菌酚氧化酶阳性，尿素酶检查阳性，可以同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、肌醇，但不能发酵碳水化合物和硝酸盐。郑智薰致病隐球菌不能同化肌醇。新生隐球菌对小鼠的接种敏感，注入腹腔、大脑或静脉，1-3周内老鼠就会死亡。双相真菌细胞质、孢子、芽及辅助孢子菌为两相真菌，在体内或37 培养时呈酵母型，在室温或人工培养时呈纤维型。(d)条件致病真菌条件病原真菌的致病性不强，大部分免疫力差，或者在肿瘤、慢性消耗性疾病、器

14、官移植后，HIV患者、长期使用广谱抗生素、接受放射治疗或化疗的患者等细菌异常的话，很有可能感染。通常是内源性感染。常见菌株为念珠菌、曲霉、木霉、卡氏肺孢子菌。1.念珠菌病一般称为坎迪达。这种菌有81种，其中11种对人致病。白念珠菌是最常见的病原体，其次是白念珠菌、白念珠菌、白念珠菌。白色念珠菌是圆形或卵形圆形。直径36m .革兰阳性。以发芽的方式繁殖，可以在组织内产生芽孢子、假菌丝体，在玉米粉培养基中产生假菌丝体及厚膜孢子。直接涂上标本，染色革兰，然后用镜子检查，确认革兰阳性(着色不均匀)，圆形或卵圆形菌体或孢子及假菌丝体是念珠菌感染。Candida抗原通过ELISA，immunoblotti

15、ng方法提取患者血清进行检测。将标本接种在shabao弱培养基上，在25 或37 培养l4d后，培养基表面可能会出现奶油色酵母类型菌落。显微镜检查显示假菌丝体和芽孢子。此外，还可以确认以下实验：l)芽管形成试验：假丝酵母形成芽管，但所有假丝酵母不形成芽管，其他假丝酵母一般不形成芽管。2)厚膜孢子形成试验：将念珠菌接种到玉米粉培养基上，在念珠菌菌丝体的顶部、侧面或中间形成厚膜孢子。(3)糖同化或发酵试验：念珠菌对糖类的发酵和同化能力徐璐不同。一般来说，发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖，然后同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖和半乳糖。5)动物实验：在兔子耳静脉注射lml，或在老鼠尾静脉注射0.2毫升，

16、观察57d，观察动物是否死亡。解剖检查时，如果器官中发现多种小脓肿，则是念珠菌感染，其他念珠菌不会给动物致病。2.Aspergillus曲霉在自然界中广泛分布。900多种曲霉，对人致病的曲霉至少10种中最常见的约8种。曲霉是免疫功能减弱时引起疾病的病菌，例如广泛的抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、放射治疗、化疗、各种恶性肿瘤、糖尿病、艾滋病等。曲霉可以侵犯身体的不同部位，特别是在呼吸系统中，系统性曲霉有增加的趋势。曲霉是直接感染和变态反应，可能导致曲霉发生，黄曲霉毒素、杂色曲霉素起致癌作用，黄曲霉毒素可能与人类原发性肝癌的发生有关。将标本涂在玻璃片上，在镜子上套树枝的菌丝体，更粗的分生孢子头

17、，顶部膨胀，上部囊上有小茎，小茎上有许多小分生孢子的特征结构。分离培养及查明标本，接种沙子弱的琼脂，在室温下培养，然后形成黄绿色毛型菌落。涂层显微检查显示特征性分生孢子头和足细胞。菌株是由不同的形态和殖民地特性决定的。免疫学检查：利用竞争性ELISA测定患者血清中曲霉抗原。患者血清中的抗曲霉抗体一般通过免疫扩散、对流免疫电泳、ELISA、生物素-亲合免疫吸附分析、放射免疫测定(RIA)和间接免疫荧光法检测。菌丝和培养滤液可用作ELISA抗原。毛霉毛霉有7个科，主要是毛霉。根霉属的根霉、木霉、木霉、根霉经常引起根霉。其中根霉属的根霉和根霉最多。艾滋病、慢性消耗性疾病(如糖尿病、白血病)等免疫功能低下的患者，长期化疗、器官移植、自身免疫疾病患者长期使用免疫抑制剂和皮质类固醇最容易感染。这种病最初经常发生在鼻粘膜或鼻窦，接着是眼眶软组织、入口和大脑扩张，可能发生在肺、胃肠、皮肤等，也可能扩散到全身，临床上眼睛和中枢神经系统的毛霉菌病菌很常见，死亡率很高。4.卡氏肺原细胞增多症名为卡氏肺囊虫的肺孢子虫。近年来，卡氏肺孢子虫肺