BrdU染色原理和步骤PPT课件

1、。1，BrdU染色的原理和步骤，YTH-仙源如霞简介，EDU染色法，BrdU染色原理，BrdU(5-溴脱氧尿苷)是胸腺嘧啶的衍生物，通常用于标记活细胞中新合成的DNA，并能取代胸腺嘧啶选择性地整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。这种掺入可以稳定地存在，同时将DNA复制到子细胞中。BrdU特异性抗体可用于检测BrdU掺入，从而判断细胞增殖能力。BrdU特异性抗体可用于检测BrdU掺入，从而判断细胞增殖能力。3，在体内注射或细胞培养后，通过使用抗Brdu单克隆抗体和ICC染色显示增殖细胞。同时，结合其他细胞标志物，双重染色可以判断增殖细胞的类型和增殖速度，对细胞动力学的研究具有重要意

2、义。由于组织和细胞中没有内源性Brdu，Brdu被广泛使用。掺入双链DNA的Brdu通过氢链与腺嘌呤结合，不能与抗Brdu抗体直接反应。Brdu只有在熔化后才能被染色。常用的熔化方法有盐酸加热、蛋白酶处理等。使DNA的双链部分为单链，抗Brdu鼠单克隆抗体与增殖细胞核中的Brdu结合，然后与酶标记的抗鼠IgG抗体一起孵育并染色，显示进入S期细胞的情况。4，改进和发展，因为盐酸和蛋白酶处理可以引起抗原或组织形态的改变。因此，Conchorov(1985)制备了一种单克隆抗体(Bu1)，其上清液可与双链DNA的Brdu反应，因为上清液中含有dnase，可分解双链DNA，暴露Brdu，达到染色的目的

3、。经戊二醛固定和胃蛋白酶、盐酸处理后，染色效果良好。当通过双重或多重染色观察哪些细胞分裂和增殖时，我们应该首先染色其他抗原物质，最后显示Brdu。通常，第一抗体染色后，用1%戊二醛固定510分钟，重复染色程序，可获得满意的染色结果，有丝分裂核呈棕色；当其他抗原用碱性磷酸酶标记时，细胞质是红色或蓝色的。5。操作步骤(1)，(1)将细胞接种在细胞数为1.5105个/毫升的直径为35毫米的皮氏培养皿中(内部放置一个盖玻片)，培养1天，并与含有0.4FBS的培养基同步培养3天，使得大多数细胞处于g 0期。(2)加入BrdU(储备溶液：1.0毫克/毫升，最终浓度：0.03克/毫升)37分钟，孵育40分钟

4、。(3)丢弃培养液，用PBS洗涤载玻片3次。(4)甲醇/乙酸固定10分钟。6，(5)在固定载玻片上风干后，用0.3 H2O 2-甲醇灭活内源氧化酶30分钟。(6)阻断5只正常兔血清。(7)核酸用甲酰胺变性100分钟和5分钟。(8)冰浴冷却后，用PBS洗涤，加入一种抗小鼠BrdU单克隆抗体(工作浓度1: 50)，并加入PBS或血清至阴性对照。(9)采用ABC法检测，苏木精或曙红染色，显微镜下随机计数10个高倍视野中的细胞总数和BrdU阳性细胞数，计算标记指数。嘿。7，BrdU染色方案，材料和试剂氯化氢(HCl)，1 M和2 M硼酸盐缓冲液0.1 M硼砂(四硼酸钠)38.1克/升，9.0磷酸盐缓冲

5、盐水，pH 7.4，含0.1% Triton X-100。8，方法，1。石蜡包埋组织切片在继续操作前应去蜡。2.在盐酸(1 M)中冰上孵育10分钟，以打开标记细胞的脱氧核糖核酸结构。3.随后在室温下用盐酸(2 M)处理10分钟，然后在37下处理20分钟。4.酸孵育后，立即通过在室温下将样品在硼酸盐缓冲液(0.1 M)中孵育10分钟进行中和。5.用0.1% Triton X-100在PBS (pH 7.4)中洗涤3次，每次洗涤5分钟。6.继续进行免疫学和细胞化学协议中描述的标准训练程序。嘿。9、注意事项，1。BrdU的制备方法：将10毫克溶于10毫升双蒸水中，避光放置4小时。2.溴化二苯醚会对人体造成不可逆转的伤害，因此使用时要注意安全，避免吸入溴化二苯醚粉尘。edu edu BrDU染色法的演变(5-乙炔基-2-脱氧尿苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它的炔基在天然化合物中是罕见的，而且它可以取代胸腺嘧啶(t)渗入到在DNA复制过程中合成的DNA分子中。基于阿波罗荧光染料与EdU的特异性反应，可以直接、准确地检测出DNA的复制活性，广泛应用