丝氨酸蛋白酶水解机制_第1页
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1、4.4.5丝氨酸蛋白酶的水解机理，什么是丝氨酸蛋白酶？丝氨酸蛋白酶是一个蛋白酶家族，它的激活是通过活性中心的一组氨基酸残基的变化来实现的，其中一个必须是丝氨酸。丝氨酸蛋白酶在哺乳动物中起着重要作用，尤其是在消化、凝血和补体系统中。最典型的三种丝氨酸蛋白酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶属于消化酶系统，它们在胰腺囊泡中合成并分泌到十二指肠中。两者都可以催化肽键的水解，但它们对肽键的选择性不同。1.水解动力学模型，糜蛋白酶不仅能水解肽键，还能水解一般的酯键。以对硝基苯酚乙酸酯为例：对硝基苯酚乙酸酯、乙酸、对硝基苯酚和糜蛋白酶。该反应过程具有两相特征：快速反应阶段：对硝基酚离子迅速形成，与酶浓度成正

2、比。稳态反应阶段：对硝基酚离子以恒定速率缓慢形成。(决定反应速率的关键步骤)在快速反应阶段过程中，酶和底物结合释放对硝基酚离子，同时形成乙酰酶中间体；在稳态反应阶段过程中，乙酰酶中间体缓慢水解，酶被释放，与底物结合并继续释放对硝基酚离子。由于乙酰酶的缓慢水解，体系中酶的浓度降低，导致对硝基苯酚的释放速率变慢。(1)活性丝氨酸基团：二异丙基磷酰氯(dipf)能与丝氨酸基团的-羟基发生特异性反应，导致作为酶活性中心的丝氨酸残基不可逆失活。该方法可以有效地确定糜蛋白酶中的丝氨酸195是酶活性中心的必需氨基酸残基。当dipf作用于动物时，表现出高度的神经毒性。动物体内的乙酰胆碱酯酶(一种丝氨酸蛋白水解

3、酶)可以与dipf反应，使自身失活并失去乙酰胆碱的水解作用。乙酰胆碱是生物体内常见的神经传导物质，具有很高的毒性。然而，乙酰胆碱酯酶(乙酰胆碱酯酶可以将乙酰胆碱分解成无毒的乙酸和胆碱)的失活，会导致乙酰胆碱在生物体内的不断积累，最终导致生物中毒死亡，乙酰胆碱酯酶负责在完成传递信息的任务后水解乙酰胆碱。(2)活性组氨酸基团：n-对甲苯磺酰基苯丙氨酸氯甲基酮(tpck)，其中氯甲基酮基团是一种强烷基化剂，可与反应中心组氨酸-57的咪唑基团烷基化，最终导致酶失活。(3)丝氨酸蛋白酶的空间结构：通常，表达蛋白质的基因经聚合酶链反应后克隆到表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，纯化后探索结晶条件。结晶后

4、，对晶体进行x光衍射，并收集衍射图。通过一系列的计算，蛋白质的原子结构可以很快得到。牛胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶结构相似。这三种酶由约240个氨基酸残基组成，约40%的一级结构相同，活性中心的必需氨基酸也大致相同。3.催化机理(1)结构特征。以胰凝乳蛋白酶为例，其活性中心有三个必需氨基酸残基：催化三元区最显著的特点是ser-195的羟基高度极化，具有很强的亲核攻击能力。(2)亲核共价催化容易形成四聚中间体。步骤1:丝氨酸195作用于底物的肽键酰基并引发亲核攻击，形成共价四聚中间体，包括丝氨酸195的羟基、底物的酰基和氨基。第二步：四面体中间体分解，即酰基-酶中间体形成，碳-氮键断裂。肽键断裂后，r-nh2基团作为离去基团离开反应体系。这时，水分子进入，它们的氧原子攻

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